二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定

摘要

目的:为提高小分子抗体表达量,利用酵母表达系统表达二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体(ds-Diabody)并研究其生物学活性。
　　方法:从真核表达载体pLEXm-ds-Diabody中扩增出ds-Diabody基因,并将其构建到酵母表达载体中获得重组质粒pPICZαA-ds-Diabody。测序正确后,经BglⅡ线性化电转至毕赤酵母GS115中,Zeocin加压筛选高拷贝子,甲醇诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western-blot鉴定,并进行镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化。间接ELISA检测其抗原结合活性。CCK-8法检测ds-Diabody对肿瘤细胞的增殖抑制作用,划痕修复实验和Transwell系统检测其对肿瘤细胞的迁移侵袭影响,成管实验和Transwell检测其对血管内皮细胞体外成管和迁移的抑制作用,信号通路分析其作用于肿瘤细胞的机制。
　　结果:成功构建人源性抗bFGF ds-Diabody酵母表达载体,并获得4株高表达酵母工程菌,经1％甲醇诱导96 h表达量即可恒定,表达量可达158mg/L。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,目的蛋白大小约35kDa左右。通过两步纯化方案,目的蛋白的纯度可达95%以上。ELISA结果显示纯化的ds-Diabody可与bFGF更好地特异性结合,并且具有良好的稳定性。CCK-8结果显示,纯化的ds-Diabody可剂量依赖性地抑制人卵巢癌细胞株Skov3 cells,人乳腺癌细胞株MCF-7 cells,人黑色素瘤细胞株A375 cells和人肺癌细胞株A549 cells的增殖,最大抑制率分别为24.3%,56.5%,43.4%和35.4%。划痕实验和Transwell结果表明ds-Diabody可以抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。成管实验和Transwell显示ds-Diabody可以抑制血管内皮细胞的成管及迁移。信号通路分析结果表明ds-Diabody能有效阻断与bFGF相关的MAPK和Akt通路。
　　结论:研究结果表明人源性抗bFGF ds-Diabody在毕赤酵母中可获得高效表达,且具有很好的抑制肿瘤活性。

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第一部分 前言

1 bFGF促进肿瘤血管生成

2 bFGF参与肿瘤的发生发展

3 小分子抗体

4 毕赤酵母表达系统

5研究目的及意义

第二部分 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三部分 结果与分析

3.1抗bFGF ds-Diabody基因的克隆及酵母表达载体构建

3.2 重组酵母的筛选、表达优化及鉴定

3.3 酵母表达产物的纯化鉴定

3.4 ds-Diabody的浓度测定

3.5 ds-Diabody与bFGF的结合活性及稳定性

3.6 ds-Diabody对肿瘤细胞增殖的抑制作用

3.7 ds-Diabody对MCF-7细胞迁移的抑制作用

3.8 ds-Diabody对MCF-7细胞侵袭的抑制作用

3.9 ds-Diabody对HUVECs细胞成管的抑制作用

3.10 ds-Diabody对HUVECs细胞迁移的抑制作用

3.11 ds-Diabody对PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的抑制作用

第四部分 讨论与结论

第五部分 小结与展望

1 小结

2 展望

参考文献

中英文缩略词

附录

致谢