二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体抑制人肺癌细胞生长的作用研究

摘要

目的:研究二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体（抗bFGF的ds-Diabody）对人肺癌A549细胞的体内外生长抑制作用及其抗肿瘤作用机制。
　　方法:将转入抗bFGF的ds-Diabody基因的酵母工程菌GS115接种于酵母生长培养基中进行生长培养，生长培养48 h后将培养基换成诱导培养基，加入1％的甲醇进行诱导培养。酵母诱导培养上清通过硫酸铵沉淀法进行初步纯化，并通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析的方法纯化得到抗bFGF的ds-Diabody。酵母表达及纯化产物通过SDS-PAGE进行鉴定，并利用间接ELISA的方法检测纯化获得的抗bFGF的ds-Diabody的抗原结合活性。体外培养人肺癌A549细胞，利用Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）检测该抗体对人肺癌A549细胞增殖的影响。Western blot分析抗bFGF的ds-Diabody对人肺癌A549细胞中Akt和MAPK信号通路的影响。通过划痕实验分析抗bFGF的ds-Diabody对人肺癌A549细胞迁移能力的影响，利用Transwell小室分析该抗体对人肺癌A549细胞侵袭能力的影响。建立人肺癌裸鼠皮下异体移植瘤模型，研究抗bFGF的ds-Diabody对人肺癌A549细胞在裸鼠体内生长的影响。裸鼠皮下接种肿瘤细胞7天后，当出现明显的肿瘤块时（直径≥5mm），将小鼠随机分成三组，并开始给药，每三天给一次药，总共给六次药。每次给药前，称量各组裸鼠体重，测量裸鼠皮下移植瘤的体积。在第一次给药后的不同时间点（1h,71h,143h和215h）收集20μL的小鼠血样利用间接ELISA的方法检测血样中抗体的残留量。免疫组化法检测裸鼠皮下异体移植瘤中微血管密度和淋巴管密度。
　　结果:甲醇诱导酵母工程菌GS115在上清中分泌表达抗bFGF的ds-Diabody，经镍离子亲和层析和阴离子交换层析两步法纯化后获得了纯度大于90%的抗bFGF的ds-Diabody。间接ELISA实验结果表明成功纯化得到具有抗原结合活性的抗bFGF的ds-Diabody。抗bFGF的ds-Diabody可呈浓度依赖性地抑制人肺癌A549细胞株的增殖，当抗体浓度为100μg/mL时，对人肺癌A549细胞增殖抑制率为40.94%。抗bFGF的ds-Diabody可以有效地抑制bFGF/FGFR信号通路中相关蛋白的Akt和MAPK的磷酸化，该抗体以100μg/mL的浓度作用30min后，细胞内的Akt和MAPK磷酸化水平显著下降。肿瘤细胞划痕和侵袭实验中，抗bFGF的ds-Diabody能显著地抑制人肺癌A549细胞的迁移和侵袭。抗bFGF的ds-Diabody作用于皮下异体移植人肺癌A549细胞的裸鼠，给药6次后，肿瘤生长抑制率达到86.54%；在第一次给药后的不同时间点取小鼠血样进行抗体残余量检测，检测结果表明抗bFGF的ds-Diabody在给药过程中其抗体残余量能维持在30%-40%，该抗体在小鼠体内能维持相对稳定。免疫组化试验结果表明，抗bFGF的ds-Diabody组的肿瘤组织中微血管密度和淋巴管密度均有显著的下降。
　　结论:二硫键稳定的人源性抗bFGF双链抗体可通过阻断Akt和MAPK信号通路抑制人肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭；该抗体对人肺癌A549细胞在裸鼠体内生长的抑制作用与该抗体能降低肿瘤组织中微血管密度和淋巴管密度有关。

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第一部分 前言

1 血管新生与肿瘤的发生

2 bFGF与肿瘤的发生发展

3 小分子抗体

4 研究目的及意义

5 技术路线

第二部分 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三部分 结果与分析

3.1抗bFGF人源性ds-Diabody的诱导表达、纯化及性质鉴定

3.2抗bFGF人源性ds-Diabody和全长的人源性抗bFGF抗体的抗原结合活性检测

3.3 抗bFGF人源性ds-Diabody对人肺癌A549细胞增殖的影响

3.4 抗bFGF人源性ds-Diabody对bFGF信号通路中关键蛋白磷酸化的影响

3.5 抗bFGF人源性ds-Diabody对人肺癌A549细胞迁移的抑制作用

3.6 抗bFGF人源性ds-Diabody对人肺癌A549细胞侵袭的抑制作用

3.7 抗bFGF人源性ds-Diabody对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

3.8抗bFGF人源性ds-Diabody体内稳定性

3.9 抗bFGF人源性ds-Diabody对裸鼠皮下移植瘤内微血管密度和淋巴管密度的影响

第四部分 讨论与结论

第五部分 小结与展望

1 小结

2 展望

参考文献

中英文缩略词

附录

在学期间发表论文清单

硕士期间参加学术活动

致谢