自噬介导的α-突触核蛋白降解在GM1缓解MPTP所致的帕金森病中的作用研究

摘要

研究背景和目的：
　　帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是多发于中老年人的第二大神经系统退行性疾病，主要的病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经细胞的损伤和神经元内路易小体的出现。多巴胺能神经细胞的损伤是临床诊断和治疗帕金森病患者的重要依据，目前药物治疗的靶点也多数围绕恢复多巴胺神经递质的水平，如抑制单胺氧化酶B、激动多巴胺受体和抑制胆碱能神经等；但基于改善多巴胺水平的临床治疗药物并不能彻底治愈帕金森病，另一方面，针对降解或清除路易小体的药物还处于研究阶段。异常聚集的α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）是路易小体的最主要成分，此蛋白在神经元内能够调节突触囊泡的循环、多巴胺的释放、酪氨酸羟化酶（TH）的活性等，因此清除异常聚集的α-syn可能是治疗帕金森病的潜在靶点。
　　神经节苷脂（GM1）是临床用于治疗帕金森病的药物。动物行为学实验和临床数据都证明GM1具有缓解帕金森病症状的效果，能够修复受损的神经元；但其具体的分子机制仍需要进一步探索。本实验旨在探索GM1保护MPTP诱导的帕金森病损伤的作用机制。
　　研究方法：
　　（1）在动物水平上评价GM1抗PD的药效，同时观察GM1与自噬的关联
　　实验使用C57BL/6小鼠，分组情况为：空白对照组、GM1高剂量组（GM1-H）、MPTP模型组、MPTP+GM1低剂量组（MPTP+GM1-L）、MPTP+GM1高剂量组（MPTP+GM1-H）、MPTP+3-MA+GM1高剂量组（MPTP+GM1-H+3-MA）和MPTP+司来吉兰组（MPTP+Sele），每组15只。除空白对照组和GM1高剂量组，其他小鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg/d），连续注射5天，建立帕金森病的亚急性动物模型。MPTP造模5天后，根据组别连续两周给予相应的GM1、3-MA和Sele，空白对照组和MPTP组给予相应的生理盐水。GM1给药方式为腹腔注射，低剂量为25 mg/kg/d，高剂量为50 mg/kg/d；3-MA给药方式为腹腔注射，于GM1给药前30分钟先注射，剂量15 mg/kg/d；Sele给药方式灌胃，剂量为60 mg/kg/d。给药结束后对小鼠进行行为学实验的评价，包括爬杆实验、转棒实验和CatWalk步态分析，分别检测小鼠的运动能力。
　　（2）在细胞水平上探索GM1抗PD的作用机制
　　用MPTP的活性代谢产物MPP+造成SH-SY5Y细胞的帕金森病损伤模型。然后在MPP+损伤基础上给予一系列浓度GM1（去掉含有MPP+的培养液，加入含有GM1的培养液），观察其对细胞损伤的保护作用，最终选择40μM GM1作用24小时。
　　使用显微镜观察 GM1对 MPP+作用后细胞形态的影响，采用 Western Blot检测GM1对PD模型细胞α-syn和酪氨酸羟化酶（TH）水平的影响，同时观察GM1对自噬相关蛋白LC3I向LC3II转化作用的影响。采用Western Blot和激光共聚焦显微镜观察GM1对正常SH-SY5Y细胞自噬量的影响。最后采用激光共聚焦显微镜观察α-syn和LC3标记的自噬小体的共定位，以探索GM1与自噬介导的α-syn清除的关联。
　　研究结果：
　　（1）动物实验结果发现 MPTP模型组与对照组在爬杆实验、转棒实验和CatWalk步态分析方面都显示出差异；阳性药司来吉兰（Sele）组与模型组相比，小鼠运动能力得到明显恢复。MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H与MPTP组相比，行为学数据均有明显改善，表现为小鼠爬至杆底所用时间较MPTP组显著减少，在转动的滚轮上持续跑动的时间明显增加，步态分析检测显示MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H组小鼠的运动轨迹规律性更加明显，速度显著提高，步频增加，速度更加稳定。而MPTP+GM1-H+3-MA组与MPTP+GM1-H相比，小鼠的运动能力的恢复又被逆转。GM1-H组小鼠的行为学指标均与空白对照组没有差异。
　　（2）细胞实验中，显微镜下观察 PD模型组细胞变得细长，内部出现空泡；给予40μM GM1后，细胞形态得到改善。Western Blot分析检测蛋白水平，发现GM1能够明显增加TH的水平，减少单体α-syn的水平。进一步的实验发现，同自噬促进剂和抑制剂相比，GM1能够增加自噬标记蛋白LC3II与LC3I的比例。GM1在浓度40μM和作用24小时时能最大程度促进正常SH-SY5Y细胞自噬量。串联的荧光蛋白标记LC3，发现随时间延长至24 h，GM1使绿色和红色荧光蛋白的共定位明显增加，红色荧光蛋白也明显增加。共聚焦显微镜下，发现 GM1能够增加α-syn和LC3标记的自噬小体的共定位。
　　结论：
　　动物实验结果说明GM1能够缓解MPTP诱导的C57BL/6小鼠帕金森病的症状；细胞实验的结果显示 GM1能够增加 SH-SY5Y细胞的自噬水平，促进自噬介导的α-syn的清除。

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第一章 前言

第一节 帕金森病与α-突触核蛋白的关系

第二节 自噬与帕金森病

第三节 GM1与神经系统疾病的研究进展

第四节 立题依据和研究内容

第二章 GM1对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的保护作用研究

第一节 GM1对帕金森病模型小鼠行为学的改善作用

第二节 本章小结与讨论

第三章 GM1对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型的保护作用和机制研究

第一节 GM1对MPP+诱导的帕金森病模型细胞的保护作用

第二节 GM1缓解MPP+损伤SH-SY5Y细胞的机制研究

第三节 本章小结与讨论

总结与展望

总结：

展望与创新点：

参考文献

致谢

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