多功能纳米复合材料负载MDR-siRNA逆转肿瘤细胞多药耐药性及多金属氧酸盐抑制Aβ聚集的研究

摘要

肿瘤细胞多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是恶性肿瘤化疗过程中面临的最常见、最棘手的问题之一，严重危害肿瘤患者的生命。肿瘤细胞一旦产生耐药性，往往导致多种化疗药物的治疗效果不佳，造成癌症复发以及恶化。大量研究表明，肿瘤多药耐药的产生是由多种基因、多种生命过程联合参与调控的复杂过程，目前已知的耐药机制非常多样且复杂。因此，逆转肿瘤耐药性是当今癌症治疗的一大热点，如何提高肿瘤细胞对化学治疗药物的敏感性以及克服肿瘤多药耐药性，是生物化学和临床医学亟待解决的重要问题。
　　小干扰RNA（siRNA）可以特异性的抑制某些基因的表达，在靶向基因治疗领域具有重要的应用价值。但是，随着研究的深入，RNA干扰技术在临床应用中依然存在许多亟待克服的障碍，主要包括体内 siRNA传送体系、生化稳定性、siRNA的脱靶效应、免疫刺激和毒性等。其中，如何将siRNA高效、安全的传送到靶向部位更是直接关系到治疗的成败。为此，人们广泛研究了各类传送siRNA和化学药物的载药体系，如阳离子聚合物PEI、壳聚糖、多肽以及各类无机纳米粒子，并应用于逆转癌细胞耐药性等治疗的新难题。这些新型的载药体系都表现出了很好的基因沉默效率，有的还取得令人振奋的抗肿瘤治疗效果。
　　阿尔茨海默病（AD），即老年痴呆症，是一种以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性疾病，目前大多数学者都认为大脑中Aβ的代谢异常引起Aβ聚合沉积从而形成β淀粉样蛋白斑在AD的发生发展中起关键作用。因此有效的防止或减少Aβ在脑内的聚集，是治疗AD的重要策略之一。
　　基于上述的研究背景，本论文中设计合成了一系列功能化纳米材料，系统研究了它们作为siRNA基因载体及联合治疗克服肿瘤细胞多药耐药性的能力，旨在寻找潜在的克服肿瘤细胞多药耐药性的siRNA核酸药物。全文共分为四个章节。
　　第一章：绪论，简要介绍了治疗癌症过程中MDR的发生机制以及当前克服 MDR的两种主要方法，同时阐述了当下siRNA核酸药物治疗恶性肿瘤中面临的挑战。最后重点介绍了纳米材料作为 siRNA载体联合化学药物疗法在克服肿瘤细胞多药耐药性上的应用与进展及本课题的选题目的和意义。
　　第二章：我们采用手性氨基酸（L/D-Arg）修饰的纳米硒，结合双核钌配合物构建了两种新型的手性siRNA载体（Ru@L-SeNPs、Ru@D-SeNPs），研究其负载靶向MDR-1基因的siRNA来逆转耐顺铂细胞A549R多药耐药性的性能。我们首先研究了三种载药体系在A549和A549R细胞中的基因沉默效率、细胞毒性以及相关的凋亡机理。其次，我们通过肿瘤细胞异种移植裸鼠模型进一步研究了Ru@L-SeNPs-siRNA的体内抗肿瘤效应，并通过体内荧光成像对载药体系进行实时追踪，研究药物的靶向性以及在或体内的分布。结果表明，Ru@L-SeNPs-siRNA能协同运输化疗药物和基因药物，显著下调 P-糖蛋白的表达，增强胞内药物的聚集，从而增加胞内钌配合物的疗效，并通过激活p53、MAPKs和PI3K/Akt信号通路诱导A549R细胞的凋亡。体内研究发现，Ru@L-SeNPs-siRNA传送体系能够显著增强荷瘤小鼠的抗肿瘤效应，并对正常器官无明显损伤。
　　第三章：我们设计合成了纳米硒/纳米钌功能化的金属有机骨架化合物（Se@MIL-101和Ru@MIL-101），利用 MIL-101孔道的可修饰性和大的比表面积构建了两种新型纳米siRNA载体，研究其同时负载靶向MDR-1基因的P-siRNA和靶向VEGF的V-siRNA，来逆转耐紫杉醇细胞MCF-7/T多药耐药性的性能。首先，我们评估了两种载药体系在MCF-7和MCF-7/T细胞中的基因沉默效率、细胞毒性以及相关的凋亡机理。其次，我们着重研究了纳米粒子对肿瘤细胞骨架微管蛋白的影响。最后，我们通过肿瘤细胞异种移植裸鼠模型进一步研究了Se@MIL-101-(P+V)siRNA的体内抗肿瘤效应。结果表明，Se@MIL-101-(P+V)siRNA或Ru@MIL-101-(P+V)siRNA不仅表现出高效的基因沉默效应，能够下调P-gp和VEGF的表达，还能够通过改变Bcl-2/Bax的表达、激活caspase-3及调控 PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途径诱导细胞凋亡。并且 Se@MIL-101和Ru@MIL-101可以显著影响细胞内微管蛋白的稳态，扰乱正常有丝分裂纺锤体的形成，能够阻滞细胞周期于G1期从而抑制细胞增殖。
　　第四章：本章设计合成了一种掺杂钒的多钼氧酸盐。进一步在分子水平上改变多钼氧酸盐纳米晶的形貌和结构特性，探究总结 Mo-POMs与 Aβ聚集之间的科学关系。我们采用具有靶向脑部Aβ能力的多肽对Mo-POMs进行修饰，合成了一个新型的多肽-多金属氧酸盐纳米复合物Peptide@Mo-POM。结果表明，Peptide@Mo-POM能够有效抑制 Aβ40自身的聚集和Zn2+诱导的纤维化。同时，对于已经形成的Aβ纤维还表现出了良好的降解能力。在体外细胞实验研究中发现，Peptide@Mo-POM能有效增加 PC12细胞的活性，对细胞起到保护作用，并且能有效降低 Aβ40纤维对 PC12凋亡诱导能力，降低活性氧水平。最后，通过构建 BBB体外模型研究发现，Peptide@Mo-POM具有良好的透过血脑屏障的能力。

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2 肿瘤多药耐药性的机理

1.3 逆转肿瘤多药耐药性

1.4 干扰小RNA技术

1.5 siRNA传送载体

1.6 多金属氧酸盐作为阿尔兹海默症（AD）抑制剂的研究

1.7 本课题的选题意义和研究目的

参考文献

第二章 钌配合物-纳米硒荧光复合材料作为siRNA载体及其抗肿瘤活性的研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

参考文献

第三章 金属有机骨架化合物作为siRNA载体逆转肿瘤细胞耐药性及其对细胞微管的影响

3.1 引言

3.2实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

参考文献

第四章 Aβ靶向多肽功能化的钼多金属盐酸盐纳米在阿尔兹海默症中的应用

4.1 引言

4.2实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

参考文献

硕士期间论文发表情况

致谢