阿魏酸对HUVECs冷刺激模型TRPM8/HIF-1α/ET-1信号通路影响研究

摘要

目的：本课题是国家自然科学基金项目―当归四逆汤解痉通脉机制研究的一部分。当归是当归四逆汤的主药，阿魏酸是当归的主要活性成分。本课题通过建立不同温度HUVECs急性冷刺激模型，观察阿魏酸是否通过TRPM8/HIF-1α/ET-1信号通路介导ET-1合成和分泌，调控ET-NO平衡，参与内皮依赖性血管收缩舒张功能调节。
　　方法：HUVECs培养至95％融合后，分别用18℃、4℃刺激5小时，空白对照组培养温度保持37℃，阿魏酸干预使用50μM、100μM、200μM三个剂量组，并分别设置TRPM8拮抗剂AMTB组（20μM）及TRPM8激动剂WS-12（20μM）。采用MTT法检测HUVECs细胞活性，收集培养基上清和细胞，生化检测细胞培养液中NO含量和LDH活性。ELISA法检测细胞培养液中ET-1含量，Q-PCR法检测HUVECs TRPM8、iNOS、eNOS、ET-1 mRNA表达，Western Blot法检测HUVECs TRPM8、HIF-1α、iNOS、eNOS、ET-1蛋白表达。正态分布的计量资料以x?s表示，采用完全随机设计资料的方差分析，组间比较采用 SNK法或Tamhane`s T2法。
　　结果：与空白对照组相比，18℃模型组HUVECs形态无明显改变，4℃模型组细胞皱缩，边缘不规则，细胞间距增大；18℃模型组培养基中 LDH活性和 ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表达水平显著增强（P＜0.05），培养基中NO含量、eNOS表达水平显著降低（P＜0.05）；4℃模型组培养基中 NO含量、LDH活性和HUVECs细胞活力显著增强（P＜0.05），培养基中ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1、eNOS和HIF-1α表达水平显著降低（P＜0.05）。与18℃模型组相比，中、高剂量阿魏酸组培养基中LDH活性和ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表达水平显著降低（P＜0.05），拮抗剂组培养基中ET-1含量和激动剂组培养基中LDH活性和iNOS表达水平显著降低（P＜0.05），培养基中NO含量、eNOS表达水平显著增强（P＜0.05），激动剂组培养基中 ET-1含量、ET-1和 HIF-1α表达水平显著增强（P＜0.05）。和18℃激动剂组相比，激动剂+阿魏酸组培养基中ET-1含量、ET-1、iNOS和HIF-1α表达水平显著降低（P＜0.05）。与4℃模型组相比，中、高剂量阿魏酸组细胞活力、TRPM8、eNOS和 HIF-1α表达水平显著增强（P＜0.05），拮抗剂组培养基中 LDH活性和激动剂组细胞活力显著增强（P＜0.05），拮抗剂组细胞活力和激动剂培养基中 LDH活性显著降低（P＜0.05）。
　　结论：1、不同温度低温暴露对TRPM8表达呈相反影响，18℃上调TRPM8表达，4℃下调TRPM8表达；2、18℃冷暴露可能通过TRPM8/HIF-1α/ET-1介导内皮功能调节；3、TRPM8可能通过降低iNOS表达、提高线粒体能量代谢、保护胞膜完整性在冷暴露中起保护作用；4、阿魏酸对 TRPM8表达呈双向调节作用，其趋向使不同温度冷暴露HUVECs TRPM8表达回归初始水平，阿魏酸通过抑制TRPM8表达减少ET-1分泌。

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第一章 绪论

1.1 中医对血虚寒凝的认识

1.2 现代医学对寒冷相关疾病的认识

1.3 阿魏酸药理学研究现状

第二章 阿魏酸对18℃HUVECs急性冷暴露模型TRPM8/HIF-1α/ET-1通路影响

2.1 实验目的

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 阿魏酸对4℃HUVECs急性冷暴露模型TRPM8及细胞膜完整性影响

3.1 实验目的

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录

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致谢