肥胖儿童脂质代谢通路相关基因变异与NAFLD关联分析

摘要

背景及研究目的：随着肥胖儿童发病率增加，非酒精性脂肪肝成为了儿童最常见的肝病之一。NAFLD是一组疾病，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化，随着疾病的发展可能会导致肝脏纤维化、肝功能受损，甚至导致肝硬化，严重威胁儿童健康。儿童NAFLD发病机制仍不清楚，研究显示遗传背景对于儿童脂肪肝具有更重要的决定作用。肝脏脂质代谢失衡是非酒精性脂肪肝发病的始动因素，脂质代谢通路中相关基因变异可能导致肝脏脂质代谢不平衡，使脂质在肝细胞内蓄积，从而导致脂肪肝的发生。因此本研究的目的旨在探讨肥胖儿童脂质代谢通路中的相关基因变异对NAFLD发病易感性的影响，筛选与肥胖儿童NAFLD相关遗传易感性的遗传标志；建立基于遗传易感性的肥胖儿童NAFLD危险性评价模型。 方法：随机抽取深圳市3所中小学进行常规体检（6~18岁），符合纳入标准的肥胖儿童368例，分为NAFLD及non-NAFLD两组，超声检查结果检出NAFLD儿童143例，占全部肥胖儿童比例为38.85%。计算体质指数，并进行生化检测及核磁共振成像（1H MRS和Dixon技术）对肝脏进行脂质定量分析；提取外周血DNA，利用目标基因芯片捕获测序技术对36个脂质代谢相关目标基因进行二代测序，并对基因变异与脂肪肝的相关性进行关联分析，探索脂质代谢通路中相关基因变异位点与NAFLD遗传易感性的关系；运用GATK对测序结果进行筛选，ANNOVAR软件进行注释和分类。 对筛选出来的儿童NAFLD相关的SNV位点，采用SIFT23,PolyPhen-2, Mutation Taster和GERP++4等软件对这些基因变异位点对蛋白质功能影响进行预测，利用ELISA检测血清中相关基因蛋白水平，并分析相关基因的基因型与血清蛋白表达的关系。 在显性、隐性、加性模型3种遗传模型下计算遗传风险评分(genetic risk score，GRS)，以3种模型分析结果中最小P值作为P-min，计算假阳性报告率(FPRP)，根据P-min和FPRP为指标筛选与NAFLD相关的SNV位点。以FPRP＜0.2的SNV位点为易感性标志，分析不同遗传风险程度SNV对肥胖儿童NAFLD发病风险影响，并分析脂质代谢通路中相关基因变异与NAFLD临床表型之间的联系。 结果：1，36个基因共检测出494个变异位点，经过功能筛查后检出有效变异位点98个，将等位基因位点与NAFLD进行关联分析，比较各基因位点在NAFLD和NCBI中国人群的频率分布，发现28个基因位点有统计学意义(P＜0.05)，其中有2个SNV位点的FPRP＜0.2，分别为编码含patatin样磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain-containing protein3)基因位点PNPLA3rs2076213(OR=0.309;95%CI=0.037～2.567,p=0.013)可以降低NAFLD发病风险，而编码载脂蛋白B100基因位点APOB rs186544754(OR=3.194;95%CI=0.239～42.749,p＜0.001)突变型等位基因增加肥胖儿童NAFLD的发病风险；2，将基因型与NAFLD进行关联分析，发现P-min＜0.05及FPRP＜0.2的有2个SNV位点，分别为编码微粒体甘油三酯转运蛋白（MTTP或MTP）的基因位点MTTP rs2306986(OR=2.588;95%CI=1.013～6.614,p=0.038)、甲肾上腺素转运体基因SLC6A2rs3743788变异位点(OR=6.111;95%CI=1.359～27.475,p=0.015)，可以增加肥胖儿童NAFLD发病风险；3，上述4个基因突变位点计算遗传评分(GRS)分析基因互作对NAFLD发病影响，趋势检验表明随着危险等位基因数目的增加，NAFLD发病危险性趋势增加，呈剂量反应关系(P=0.021),与GRS评分为0的儿童比较，GRS为7~8分的肥胖儿童NAFLD的风险增加3倍左右；4，进一步采用Logistics回归对临床测量指标及生化指标进行校正分析，发现MTTP rs2306986(OR=23.468，95%CI：1.083~508.515,p=0.044)位点变异是影响NAFLD发生的独立危险因素，ELISA检测其血清蛋白表达水平发现该位点变异显著影响蛋白表达；5，NAFLD儿童的体质量、腰围、丙氨酸氨基转移酶、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白和载脂蛋白B均显著高于non-NAFLD儿童（P均＜0.05）；天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、载脂蛋白A1、空腹血糖、胰岛素，高密度脂蛋白、游离脂肪酸以及稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）两组比较无显著性差异（P＞0.05）。 结论：本研究结果提示脂质代谢通路中相关基因变异位点与肥胖儿童NAFLD发病易感性有关，其中MTTP rs2306986位点变异可以增加肥胖儿童NAFLD发病风险，是肥胖儿童NAFLD的独立风险因素；SLC6A2rs3743788变异位点则可能通过改变行为习惯等而对肥胖儿童NAFLD产生间接影响；PNPLA3rs2076213和APOB rs186544754位点突变可能参与肥胖发生而影响脂肪肝发病。