鼻腔滴注脂质体Tat-haFGF14-154治疗APP/PS1小鼠阿尔茨海默病及其作用机制研究

摘要

目的: (1)探索突破血脑屏障的新型给药系统,促进药物进入脑内,提高局部药物浓度,为阿尔茨海默病(Alzheimer,AD)等大脑中枢神经退行性病变的临床治疗手段提供新策略; (2)考察脂质体Tat-haFGF14-154在APP/PS1小鼠AD模型中的治疗作用,同时以ADAM10为靶点在体外深入探讨Tat-haFGF14-154神经保护的作用机制,为Tat-haFGF14-154应用于AD等神经退行性疾病的治疗提供药理学基础和依据. 方法: (1)根据ELISA法检测的脂质体Tat-haFGF14-154包封率确定脂质体药物制备的最佳条件,并用考马斯亮蓝染色检测脂质体Tat-haFGF14-154的聚合情况. (2)通过鼻腔滴注的给药方式将脂质体Tat-haFGF14-154递送到正常小鼠脑内,Western blotting检测aFGF在嗅球和皮质的分布情况. (3)采用APP/PS1转基因小鼠为AD模型动物,AD鼻腔滴注脂质体Tat-haFGF14-154(600μg/kg,隔天给药,共6周),通过认知与非认知行为学检测、对皮质与海马区突触相关蛋白的表达、Aβ沉积以及Aβ代谢相关蛋白的表达和活性进行分析,开展鼻腔滴注脂质体Tat-haFGF14-154治疗AD药效学实验研究. (4)运用Aβ1-42损伤的大鼠原代皮质神经元建立AD细胞模型,并用60、300、1500ng/mL的Tat-haFGF14-154进行给药处理,通过MTT检测细胞活力、扫描电镜观察神经元结构完整性和免疫荧光检测突触相关蛋白的表达来评价Tat-haFGF14-154对损伤神经元的保护作用.在此基础上,通过Western blotting、RT q-PCR、siRNA干扰技术以及信号通路抑制剂实验等技术,深入探讨以ADAM10靶点的Tat-haFGF14-154神经保护作用的分子机制与信号通路. 结果: (1)优化并确定了制备脂质体Tat-haFGF14-154的最优条件为:脂质体与Tat-haFGF14-154质量比1∶2,25oC下孵育0.5h,脂质体药物的包封率可达到97%. (2)鼻腔滴注脂质体Tat-haFGF14-154较Tat-haFGF14-154明显提高aFGF在正常小鼠皮质内的含量. (3)鼻腔滴注脂质体Tat-haFGF14-154明显改善APP/PS1小鼠的认知和非认知行为学;增加了APP/PS1小鼠脑内SYN和GAP43的表达并降低了Aβ斑块的沉积;显著提高了APP/PS1小鼠脑内ADAM10的表达和活性,对IDE和NEP的表达无影响. (4)体外AD细胞模型实验结果表明,Tat-haFGF14-154可以显著提高Aβ损伤的神经元活力、上调SYN和GAP43表达,逆转Aβ造成的神经元胞体和轴突的损伤,并且具有明显的量效依赖关系;降低Aβ损伤的原代神经细胞中Aβ的沉积并明显提高ADAM10的表达、活性和具有神经保护作用的sAPPα的分泌. (5)siRNA对原代神经元的ADAM10进行沉默后,在被Aβ损伤的原代神经元中,Tat-haFGF14-154对Aβ沉积的减少和sAPPα释放的增加效应被阻断,对神经元活力的提升和突触的保护效应也被显著抑制;同时对调控ADAM10表达的上游靶蛋白进行筛选和检测后发现,Tat-haFGF14-154激活了PI3K-CREB-IRE1α/XBP1-ADAM10信号通路,然而当加入PI3K抑制剂干预后,Tat-haFGF14-154对Aβ诱导的神经元保护效应受到显著性的抑制或阻断. 结论: (1)鼻腔滴注和脂质体载体联用的给药系统显著提高了进入脑内的haFGF药物浓度,并提升了Tat-haFGF14-154对APP/PS1小鼠神经退行性病变的治疗效果. (2)Tat-haFGF14-154对APP/PS1模型小鼠和Aβ损伤的原代皮质神经元的神经保护作用机制与促进ADAM10的表达与活性从而减少Aβ生成,改善神经元微环境,维持突触正常结构有关. (3)ADMA10是Tat-haFGF14-154在AD模型中发挥神经保护作用的重要靶标分子,Tat-haFGF14-154通过激活PI3K-CREB-IRE1α/XBP1信号通路促进了ADAM10的转录表达.

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