脑靶向载RAGE拮抗肽纳米递释系统的构建研究

摘要

目的： RP-1是一种晚期糖基化终末产物受体（RAGE）拮抗肽，体外试验表明其具有缓解Aβ诱导的神经细胞毒性的功能。本论文探讨以聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒作为RP-1的载体，以穿膜肽TAT和脑靶向肽Angiopep-2修饰纳米粒表面，构建脑靶向载RP-1纳米粒，为将RP-1用于阿尔茨海默症（AD）治疗的后续研究提供实验基础。 方法： 采用乳化溶媒蒸发法制备PLGA空白纳米粒，对纳米粒制备条件进行单因素考察，进而确定对纳米粒粒径有影响的4个因素，每个因素设定3个水平，以纳米粒粒径为评价指标，建立四因素三水平正交表进行正交试验，通过极差分析确定纳米粒的最佳制备工艺条件，并对最佳工艺进行验证，测定空白纳米粒（NP）的粒径、Zeta电位和多分散系数（PdI）。 以最佳制备工艺制备纳米粒，通过透射电镜（TEM）进行形态观察；对纳米粒表面采用穿膜肽TAT和脑靶向肽Angiopep-2进行修饰，得到TAT-NP和ANG-NP，采用总巯基检测试剂盒分别测定穿膜肽TAT与脑靶向Angiopep-2的修饰效率，并对修饰后的纳米粒进行表征，测定其粒径和Zeta电位。 建立香豆素-6的HPLC分析方法，采用离心取样法测定载香豆素-6纳米粒（Cou-6/NP）的包封率（Entrapping efficiency,EE）和载药量（Drug loading capacity,DLC），并测定纳米粒48h内体外释放特性；建立RP-1的HPLC体外分析方法，测定载RP-1纳米粒（RP-1/NP）的包封率（EE）和载药量（DLC）； 制备NP、TAT-NP、ANG-NP、TAT/ANG-NP四种纳米粒，CCK-8法考察纳米粒对脑血管内皮细胞（b.End3细胞）的体外毒性。制备载近红外染料DiR的纳米粒（DiR/NP），考察DiR不同投药量对DiR/NP包封率（EE）和载药量（DLC）的影响；采用离心取样法考察48h内DiR/NP的体外释放特性；选择C57BL/6小鼠为实验动物，分别等剂量尾静脉注射DiR/NP、ANG-DiR/NP和TAT/ANG-DiR/NP三种不同纳米粒，活体荧光成像考察1h后不同纳米粒入脑情况。 结果： PLGA-PEG-Mal和PLGA-MePEG的总量、超声时间、分散相胆酸钠溶液的浓度以及内水相胆酸钠溶液的浓度对纳米粒的粒径具有不同程度的影响；通过正交试验进行条件优化，最佳工艺条件制备所得的纳米粒粒径为142.8nm，Zeta电位为-11.93mV，多分散系数（PdI）为0.161。 对纳米粒进行形态观察，在透射电镜下，纳米粒大小均一，外观圆整；TAT-NP和ANG-NP的修饰率分别为65.4%和71.1%；经修饰后的纳米粒，表面Zeta电位发生了变化。 制备Cou-6/NP、TAT-Cou-6/NP和ANG-Cou-6/NP三种纳米粒，得到纳米粒的包封率分别为38.210%、27.311%和38.377%，载药量分别为0.229%、0.164%和0.230%；测定纳米粒48h内体外释药特性，结果香豆素-6在48h内的累积释放率小于8%；制备载RP-1的纳米粒，其包封率为33.847%，载药量为0.847%； 通过CCK-8法考察NP、TAT-NP、ANG-NP、TAT/ANG-NP四种纳米粒的体外细胞毒性，纳米粒在12.5-800μg/ml的浓度范围内基本无细胞毒性。按照不同DiR投药量制备DiR/NP，结果表明在投药量为2%时，载药量和包封率均较大；对DiR/NP的体外释药特性进行考察，在48h内，DiR/NP的累积释放率约为30%；通过活体荧光成像实验观察DiR/NP、ANG-DiR/NP和TAT/ANG-DiR/NP在给药1h时的入脑情况，结果在1h时，三种纳米粒的入脑量分别为TAT/ANG-DiR/NP＞ANG-DiR/NP＞DiR/NP。 结论： 1.通过单因素试验及正交试验对纳米粒的制备工艺条件进行筛选，纳米粒的最佳制备工艺条件是：内水相中胆酸钠浓度为1.5%，PLGA-MePEG与PLGA-PEG-Mal总用量为5mg，PLGA-PEG-Mal与MePEG-PLGA比例为1：9，分散相胆酸钠浓度为0.1%。 2.采用TAT和Angiopep-2对纳米粒成功进行表面修饰，修饰率分别为65.4%和71.1%。 3.单位时间内载药纳米粒的累积释放率较低，其稳定性较好。 4.在12.5-800μg/ml的浓度范围内无细胞毒性，制备所得的纳米粒可以作为安全的脑靶向药物载体。 5.经TAT和Angiopep-2修饰的纳米粒脑靶向性能较好，适合作为药物脑靶向递送的载体。

目录

声明

第一章 前 言

1. 阿尔茨海默症的发病机制

2.纳米技术及纳米载药系统

3. PLGA纳米载药系统

4.课题思路

5.技术路线

第二章 PLGA纳米粒的构建与制备工艺优化

1．实验仪器与材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.本章小结

第三章 载药纳米粒的表征、修饰及体外释药特性的测定

1.实验仪器与材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.本章小结

第四章 靶向肽修饰纳米粒的生物学特性考察

1.实验仪器和材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.本章小结

展望

参考文献

附录

攻读硕士期间科研情况

致谢