花生2s-4b基因克隆、原核表达及表达蛋白体外抑制肺腺癌细胞的研究

摘要

已有研究表明，花生蛋白具有一定的药用价值，但对其中的2s蛋白的药用价值研究较少。本论文着重研究花生2s-4b基因的克隆、原核表达及其融合蛋白抑制肺腺癌A549细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用，为以后进一步深入研究其抑癌机制提供实验和理论依据。
　　 以发育中后期的花生（Arachis hypogaea L.）种子为材料，根据本实验室得到的花生2s蛋白双向电泳及2s-4b的MS质谱分析结果，设计简并引物，利用RT-PCR方法进行梯度PCR扩增；根据得到的测序结果，采用RACE的方法克隆出2s-4b基因。运用生物信息学手段对2s-4b编码蛋白的结构特点、性质与功能进行分析和预测，得知其开放阅读框（ORF）共含519 bp，包括起始密码子ATG和终止密码子TAA，编码172个氨基酸，分子量为20.1 kDa，等电点为5.96。2s-4b编码蛋白的N端含有一个长约20个氨基酸的信号肽，具有AAI结构域；其二级结构主要由α-螺旋组成。
　　 根据2s-4b基因的ORF序列和原核表达载体pET-32a的酶切位点设计了两条分别含有Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的引物，以反转录产物为模板进行PCR扩增。PCR产物和载体质粒经双酶切、纯化后，利用T4连接酶进行连接并转入大肠杆菌Rosetta-gami B中。转化子经抗性筛选、PCR鉴定、双酶切鉴定和测序，证明2s-4b基因原核表达载体pET-32a-2s-4b构建成功。从诱导温度和IPTG终浓度这两方面优化重组蛋白的表达体系，SDS-PAGE电泳检测结果显示该重组蛋白以包涵体的形式存在。在28℃下用终浓度为0.5 mM的IPTG诱导培养过夜，得到大小约40 kDa的融合蛋白，其表达量占菌体体积的58％。
　　 原核表达产物的纯化采用溶菌酶和8 M尿素相结合，达到破碎细菌、包涵体变性溶解的目的，利用His·tag亲和纯化得到的目的蛋白纯度达75％以上。通过尿素梯度浓度透析复性，得到具有620 U/mg胰蛋白酶抑制活性的融合蛋白，明胶SDS-PAGE染色结果表明经胰蛋白酶消化5 h后，2 s-4b有一条抑制带出现，确定2s-4b融合蛋白具有胰蛋白酶抑制活性。
　　 通过MTT法检测不同浓度2s-4b融合蛋白体外抑制A549细胞的生长，结果显示2s-4b融合蛋白对A549细胞的抑制作用呈现剂量依赖关系，在200μg/ml 2s-4b融合蛋白作用24 h后，A549细胞生长抑制率可以达到64％以上，IC50为175μg/ml。利用倒置显微镜和HE染色观察，我们发现2s-4b融合蛋白能抑制肺腺癌细胞的生长，促进细胞凋亡，并呈现显著的量效、时效依赖关系。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

第一章 文献综述

引言

1．1 植物胰蛋白酶抑制剂的种类及其结构

1．1．1 Bowman—Birk抑制剂的结构特点

1．1．2 Kunitz抑制剂的结构特点

1．1．3 PⅠ—Ⅱ和PⅠ—Ⅱ家族的结构特点

1．2 植物胰蛋白酶抑制剂抗肿瘤的研究

1．2．1 抑制肿瘤细胞的增殖

1．2．2 细胞凋亡

1．2．3 BBI的辐射保护作用

1．2．4 抗氧化活性

1．2．5 抗炎

1．3 本论文的研究背景及研究意义

第二章 2s-4b cDNA的克隆

2．1 实验材料

2．2 实验方法和步骤

2．2．1 花生总RNA的提取

2．2．2 RNA含量和质量的测定

2．2．3 从花生总RNA合成第一链cDNA与3’—cDNA

2．2．4 2s—4b基因简并引物片段的获得

2．2．5 2s—4b cDNA 3’端的获得

2．2．6 2s—4b 的5’RACE片段的获得

2．2．7 2s—4b cDNA编码区序列的获得

2．2．8 本章涉及的DNA片段回收、连接、克隆和测序

2．2．9 2s—4b基因的序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 花生总RNA的质量分析

2．3．2 2s—4b简并引物扩增片段、3’及5’序列的获得

2．3．3 2s—4b cDNA编码区序列的获得

2．3．4 2s—4b基因序列的性质分析

2．4 讨论

第三章 2s—4b基因的原核表达

3．1 实验材料

3．2 实验方法与步骤

3．2．1 pET—32a—2s—4b原核表达载体的构建与鉴定

3．2．2 pET—32a—2s—4b融合蛋白的诱导表达

3．2．3 2s—4b重组蛋白可溶性表达条件探索

3．2．4 SDS—PAGE电泳

3．3 实验结果与分析

3．3．1 pET—32a—2s—4b原核表达载体的构建及鉴定

3．3．2 融合蛋白的诱导表达与可溶性分析

3．4 讨论

第四章 花生2s—4b重组蛋白包涵体纯化、复性及活性检测

4．1 实验材料

4．2 实验方法和步骤

4．2．1 包涵体的纯化

4．2．2 包涵体的复性

4．2．3 目的蛋白胰蛋白酶抑制活性的测定

4．2．4 肺腺癌细胞的培养

4．2．5 MTT法测定细胞生长

4．2．6 细胞形态学观察

4．3 结果与分析

4．3．1 包涵体的纯化

4．3．2 包涵体的复性

4．3．3 胰蛋白酶抑制活性的测定

4．3．4 MTT法测定2s—4b融合蛋白对A549细胞增殖的抑制作用

4．3．5 2s—4b融合蛋白对A549细胞形态的影响

4．4 讨论

结论

参考文献

致谢