猪塞内加谷病毒(SVV)的分离鉴定及致病性研究

摘要

猪塞内加谷病毒（SVV）属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae） Senecavirus病毒属成员，可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。本研究采用传代细胞(猪肾细胞)从猪组织器官研磨物中分离出4株SVV，分别命名为SVV CH-01-2015、SVVCH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015。并对4株SVV中国分离株进行全基因组序列测定。根据发表在GenBank SVV保守序列3C基因，设计特异性引物和探针；构建含3C基因序列的重组质粒作为阳性标准品，建立针对SVV检测的TaqManReal-Time PCR检测方法。将SVV细胞分离株攻毒4日龄健康仔猪，观察临床症状、病理变化，检测感染动物组织器官中的病毒载量。
　　病毒分离鉴定结果表明：病毒分离液在第一代24 h后即可产生CPE，随着传代次数的增加，出现CPE的时间缩短，细胞病变程度亦随之加剧，且可在PK-15细胞上稳定增殖。全基因组序列比对结果表明，SVV CH-01-2015与 SVV CH-02-2015、CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性为97.6％；SVV CH-02-2015与SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性为99.9%；SVV CH-03-2015与SVV CH-04-2015的相似性为100%。4株SVV中国分离株与2008年美国分离株SVV-001相比，相似性为94.3%-94.4%之间；SVV CH-01-2015与2015年美国新分离株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均为96.8%；SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与2015年美国新分离株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均为98.0%；SVV CH-01-2015与2015年巴西新分离株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均为97.1%；SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与2015年巴西新分离株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均为98.2%；SVV CH-01-2015与SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与加拿大株11-55910-3相似性均为96.7%；SVV CH-02-2015与加拿大株11-55910-3相似性均为96.6%。4株SVV中国分离株均位于Senecavirus病毒属，与Senecavirus病毒属毒株同源性最高，由此可以确定所分离到的4株均属于Senecavirus病毒属。
　　TaqMan Real-Time PCR检测方法的结果显示，TaqMan Real-Time PCR用标准品所构建的标准曲线相关系数（R2）达到0.999以上；可以检测到标准品下限浓度为1×102copies/μL；只以SVV的cDNA为模板的反应呈现阳性荧光信号，而以其它病毒的cDNA/DNA为模板所进行的Real-Time PCR均未检测到阳性荧光信号；组内与组间试验的变异系数均在0.96以下。本研究建立的TaqMan Real-Time PCR方法灵敏度高，特异性强，重复性好。TaqMan Real-Time PCR检测方法的成功建立，为SVV的定性检测和定量分析提供了有效的技术平台。
　　动物致病性试验结果表明：（1）运用人工感染方式成功在4日龄仔猪身上发现临床症状和病理变化，证明SVV对仔猪具有致病性。（2）通过同居感染处理证明SVV可能是一种接触传染病且传播速度较快。（3）SVV可在4日龄仔猪内体成功复制且病毒可能在肺、脾、扁桃体、脑部和心脏中成功复制。

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1 前言

1.1 概况

1.2 病毒的形态

1.3病毒的基因组结构及功能

1.4 SVV的发病情况

1.5诊断方法

1.6 本研究的目的和意义

2 Seneca Valley virus的分离和全基因组序列测定与分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 结论

3 Seneca Valley virus TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 材料与方法

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

4 Seneca Valley virus细胞分离毒株对仔猪致病性研究

4.1材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结论

全文总结

致谢

参考文献

附录：硕士期间论文发表情况