利用数字基因表达谱测序分析鸡HSP25基因对细胞凋亡的作用

摘要

在哺乳动物小分子热应激蛋白（sHSPs）家族中，热应激蛋白25/27kD（HSP25/27）基因的高表达能够主导聚集体沉积，防止错误折叠蛋白之间不可逆结合，从而缓解因内质网受协迫而造成的细胞凋亡。但卵生动物胚胎各组织中HSP25的序列和结构都异于哺乳动物。在热应激条件下，鸡HSP25基因（cHSP25）高表达是否也起着保护细胞的作用仍不明确。c HSP25在热应激诱导的细胞凋亡过程中涉及的信号通路未有报导，探究这些通路中的物质变化对阐明卵生动物特有的HSP25基因在细胞凋亡过程中的作用具有重要研究意义。本研究在37℃培养箱对鸡成纤维细胞系（DF-1）分别进行干扰和过表达cHSP25基因，通过数字基因表达谱（DGE）分析参与细胞凋亡的相关通路及相应基因的表达情况，利用热应激（45℃，3 h）处理DF-1，qRT-PCR检测相关基因和流氏细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明：
　　（1）干扰组cHSP25基因mRNA相对表达量下降50％；过表达组cHSP25基因mRNA相对表达量升高500倍。
　　（2）DGE测序分析结果揭示，与对照组相比，干扰组只有1个未注释的下调差异表达基因；过表达组共有95个差异表达基因，其中60个为表达量上调基因，35个为下调基因。与干扰组相比，过表达组共有32个差异表达基因，其中有19个为表达量上调基因，13个为下调基因。鸡DF-1过表达cHSP25后，K EGG通路分析发现，PPARG和 LAMA2富集于癌症通路等；BDNF富集于嗜中性粒细胞信号通路和经典MAP激酶信号通路。
　　（3）在热应激处理鸡DF-1后，过表达组的HSP27和HSP70基因的表达显著下降，差异表达基因BDNF、LAMA2和PPARG及其相关通路的下游基因 AKT和NFkB的表达量显著下调，流氏细胞术检测发现，S期细胞数增加，总凋亡细胞数增加。
　　综上所述，在热应激条件下，鸡 DF-1细胞系 cHSP25基因持续高表达促使细胞周期停滞和加剧细胞凋亡，其通过下调HSP27和HSP70基因表达，并且抑制BDNF、LAMA2和PPARG及其下游通路基因AKT和NFkB在中性粒细胞信号通路和MAPK信号通路等的作用实现。

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1 前言

2 材料与方法

2. 1 实验材料与实验设计

2. 2 主要仪器设备

2. 3 主要试剂及配制

2.3.1 主要试剂

2.3.2 主要试剂配制

2. 4 实验方法

2.4.1 细胞培养方法

2.4.2 不同温度刺激DF-1细胞

2.4.3 DF-1的总RNA抽提方法

2.4.4 DF-1总RNA反转录

2.4.5 荧光定量PCR引物设计

2.4.5 qRT-PCR检测方法的组分和程序

2.4.7 细胞凋亡检测

2.4.8 细胞周期检测

2.4.9 siRNA干扰鸡DF-1中的HSP25基因

2.4.10在鸡DF-1中过表达cHSP25

2. 5 数据分析

2.5.1 数字基因表达谱测序样品检测分析

2.5.2 荧光定量PCR检测分析

2.5.3Western Blot检测分析

2.5.4 数据处理

3 结果

3. 1 干扰cHS P2 5基因对鸡DF-1细胞系的影响

3.1.1 cHSP25干扰片段转染效果

3.1.2 干扰cHSP25对其它HSPs的影响

3.1.3 干扰cHSP25对细胞凋亡和细胞周期的影响

3. 2 过表达cH SP 25基因对鸡DF-1细胞系的影响

3.2.1 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体验证

3.2.2 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染效果

3.2.3 过表达cHSP25对其它HSPs的影响

3.2.4 过表达cHSP25对细胞凋亡和周期的影响

3. 3 数字基因表达谱测序

3.3.1 数据过滤统计

3.3.2 比对分析

3.3.3 表达量分析

3.3.4 蛋白互作网络

3.3.5 GO功能分析

3.3.6 KEGG通路分析

3.3.7 差异表达基因和下游通路基因检测

3. 4 热应激对DF-1细胞系及期相关基因的影响

3.4.1 不同温度条件下的细胞形态

3.4.2 不同温度条件下的细胞总RNA抽提和反转录

3.4.3 热应激对cHSP25表达量的影响

3.4.4 热应激对其它HSPs的表达量影响

3.4.5 热应激对差异表达基因和下游通路基因表达量的影响

3.4.6 热应激对细胞凋亡和周期的影响

3. 5 热应激条件下干扰cH SP2 5基因对相关基因和细胞的影响

3.5.1 热应激条件下cHSP25干扰片段转染效果

3.5.2 热应激条件下干扰cHSP25对其它HSPs的影响

3.5.3 热应激条件下干扰cHSP25对差异表达基因和下游通路基因的影响

3.5.4 热应激条件下干扰cHSP25对细胞凋亡和周期的影响

3. 6热应激条件下过表达cH SP2 5基因对相关基因和细胞的影响

3.6.1 热应激条件下pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染效果

3.6.2 热应激条件下过表达cHSP25对其它HSPs的影响

3.6.3 热应激条件下过表达cHSP25对差异表达基因和下游通路基因的影响

3.6.4 热应激条件下过表达cHSP25对细胞凋亡和周期的影响

4 讨论

4. 1细胞凋亡与细胞周期变化的关系

4. 2 热应激诱导HS Ps表达促进细胞凋亡

4.3 DGE测序分析的差异表达基因

4. 4下游通路相关基因的分析

5 结论

致谢

参考文献

附录