烟草种子和土壤携带三种病毒对烟苗的侵染分析

摘要

烟草，为茄科（Solanaceae）烟属（Nicotiana）一年生或有限多年生草本植物，是我国重要的经济作物之一，而烟草业在我国经济中也占据着重要的地位，每年为国家和地方的财政收入均作出了巨大贡献。目前，由烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）以及马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）引起的烟草花叶病毒病是各大烟区的主要病害之一，已成为提高烟叶产量和质量的主要限制因子，也严重影响了烟草业的发展。为了明确以上三种病毒在烟草种子和土壤带毒情况下对烟苗的侵染情况，为烟草生产实践提供参考，本研究主要进行了以下几方面研究。
　　1、利用实时荧光定量PCR，对烟草感病叶片中的三种病毒的拷贝数进行了定量。本研究根据三种病毒克隆后的阳性质粒测序得到的序列在 NCBI里比对后相似度达95％以上的序列分别设计实时荧光定量PCR特异引物，将克隆后的阳性质粒DNA以10倍梯度稀释6次作为模板建立标准曲线，确定了三种病毒实时荧光定量PCR检测方法及反应条件的合理性、可靠性；其中，本试验定量得到的三种病毒的拷贝数分别为TMV：3.72×1010copies/μL，CMV：3.68×1010 copies/μL，PVY：3.76×1010 copies/μL。
　　2、利用已知病毒拷贝数的病毒汁液磷酸缓冲液浸泡处理种子，不同时间段育苗分析了烟苗感染病毒的阳性率。结果表明，种子携带三种病毒后，TMV对烟苗的侵染能力最强，其次为CMV，再次为PVY；病毒在种子上保持侵染活性的时间PVY要强于 TMV和 CMV。本研究中分别用病毒含量为3.72×108 copies/μL、3.68×108 copies/μL、3.76×108 copies/μL的病毒汁液处理后，室温放置3个月，烟苗中无TMV和CMV检测到，放置5个月后，十字期烟苗中TMV、CMV、PVY三种病毒均未检测到。
　　3、明确了三种病毒均可以通过根部感染烟苗。本研究通过病毒汁液磷酸缓冲液浸根实验发现，5个不同病毒含量的病毒汁液浸根处理之后，均可使十字期烟苗感染三种病毒。其中分别用病毒含量为3.72×108 copies/μL、3.68×108 copies/μL、3.76×108 copies/μL的病毒汁液浸根处理后，ELISA检测三种病毒的阳性率分别在40%、26.67%、17.78%以上，而 RT-PCR检测三种病毒的阳性率分别在90%、30%、20%以上，这也表明了RT-PCR检测要比ELISA检测更灵敏。
　　4、明确了除TMV和CMV可以通过土壤传播外，PVY也可以通过土壤传播，但三种病毒在土壤中的存活期限存在差异，其中TMV存活时间最长，其次为CMV，PVY的存活时间最短，初步得出用病毒含量为3.72×108 copies/μL病毒汁液处理后，TMV在土壤中至少可以存活5个月，而CMV和PVY在土壤中的存活时间相对较短。不论是育苗基质带毒处理后不同时间段育苗还是不同时间段采集的大田土样育苗，十字期烟苗感染病毒的检测结果均一致，即随着病毒在育苗基质或者土壤中的时间越长，三种病毒对烟苗的侵染能力均下降。
　　另外，本研究对检测过的烟苗进行了症状观察实验，发现，不论是种子处理、浸根还是育苗基质处理后育苗，在十字期检测到有病毒存在的烟苗后期均会表现出花叶症状，从而影响烟叶的品质。明确病毒对烟苗的侵染规律，这在实际的生产实践中，特别是在植物病毒防治方面具有重大意义。

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1前言

1.1烟草病毒病概述

1.2 烟草3种主要病毒的生物学及分子生物学特性

1.3酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）

1.4 实时荧光定量PCR技术

1.5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 烟草叶片总RNA的抽提

3.2 烟草接种叶片（接种体）中TMV、CMV和PVY含量的检测

3.3 种子浸泡、浸根和育苗基质处理后三种病毒对烟苗的侵染

3.4 毒源烟株收种子放置1个月后育苗三种病毒对烟苗的侵染

3.5 大田土壤中三种病毒对烟苗的侵染及病毒的定量

4结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

致谢

参考文献

附录A

附录B