抗生素耐药基因在动物肠道中的排布和在微环境中的消减规律

摘要

动物生产活动极大地促进了环境中抗生素耐药基因（antibioticresistance genes，ARGs）的发生和蓄积。畜禽养殖场使用的抗菌药物不仅在动物肠道内选择了大量的ARGs，还会通过粪便进入环境中，对土著微生物产生选择压力。更为重要的是，粪便中含有的高水平背景值的ARGs会伴随着粪便，污染养殖场周边的土壤和下游河流，还会通过粪肥传播到农田和蔬菜基地，对公共健康构成潜在的危害。本文立足于此背景，研究了肉鸡肠道中ARGs的多样性和排布规律，还研究了粪便污染的土壤和水体中ARGs的消减规律和菌群的变化，最后实地调查广州市流溪河中ARGs的污染情况。本文研究的主要内容及结果分述如下：
　　1.动物肠道中耐药基因的排布规律
　　研究肉鸡的肠道中ARGs的多样性和排布规律，并且研究以金霉素作为选择压力时肉鸡肠道中ARGs的变化情况。54只肉鸡随机平均分成三组，包括空白对照组、低剂量组和治疗剂量组，每组三个重复，每个重复六只鸡。肉鸡在给予金霉素处理前后不同时间点采集鸡粪。提取鸡粪的宏基因组，运用高通量测序技术分析耐药基因的丰度和多样性，并且定位耐药基因的宿主菌，明确整合子、质粒和噬菌体上的耐药基因的排列情况。结果显示，未接触抗菌药物的肉鸡，其肠道中含有高浓度的ARGs（平均3.1ARGs/16S rRNA基因）；在正常的给药方案下，暴露于金霉素的选择压力下，肉鸡肠道中的耐药基因特别是四环素类耐药基因并没有大幅度的显著性升高。在肉鸡养殖过程中合理的抗菌药物治疗可能不会显著增加其肠道的耐药基因。肉鸡肠道中的耐药基因以多药耐药基因为主（53.1％），其次是四环素类耐药基因（9.3%）。值得注意的是消毒剂吖啶黄耐药基因污染较严重（7.6%）。携带耐药基因的丰度最高的菌属是Escherichia（83.2%），其次是Klebsiella（6.0%）和Shigella（5.0%）。试验中发现了I类整合子，携带有链丝菌素乙酰转移酶（Sat1）、氨基糖苷乙酰转移酶（AadA1和AadA2）、氯霉素类（CmlA）、季铵盐（Qac）和磺胺类（Sul3）的耐药基因。还发现噬菌体携带有膦胺霉素耐药基因（Fsm）和消毒剂吖啶黄耐药基因（AcrA和AcrB）。本实验首次解析了肉鸡肠道中ARGs的排列和分布规律。实验结果有利于指导临床合理用药，并且对肉鸡肠道的耐药传播机制如噬菌体扩散耐药性提供了有力的证据。
　　2.施粪活动对土壤中耐药基因和菌群结构的影响
　　研究了含有常用抗菌药物的猪粪污染农田土壤后，土壤中四环素类、磺胺类和质粒介导的喹诺类耐药（plasmid-mediated quinolone resistance(PMQR)基因的发生和蓄积规律，同时还分析了菌群结构的变化情况。我们将添加粪便和抗菌药物的土壤作为处理组，包括四环素类药物处理组、磺胺类药物处理组和氟喹诺酮类药物处理组。只添加粪便的土壤作为粪便组，未添加粪便和抗菌药物的土壤作为空白对照组。在第0、30和60天时运用实时荧光定量PCR检测各组中ARGs的丰度；并且在第30天时运用基于16s rRNA基因的宏基因组测序的方法分析各组中的菌群结构。结果显示施粪后土壤中大部分ARGs（四环素类耐药基因：tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ、tetX；磺胺类耐药基因：sul1、sul2、sul3；PMQR基因：oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr、qnrS）均显著增加（P<0.05）。四环素类耐药基因（tetM、tetO、tetW、tetQ和tetX）、磺胺类耐药基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr和qnrS）在粪便组的每月消减率分别是-38%至-97%、-78%至-83%和-76%至-94%，而这些ARGs在抗菌药物处理组的消减速率分别是48%至-93%、-50%至-66%和-58%至-84%。含抗菌药物的粪便显著选择了特定菌群，如磺胺类药物处理后，Steroidobacter、Bradyrhizobium、Nitrospira、Gp4、Gp6、Clostridium和 Stenotrophomonas均显著增高。结果表明，施粪活动促进了耐药基因在土壤中的发生和蓄积。粪便中含有的抗菌药物可延缓施粪土壤中由粪便带入的耐药基因的消减速度。同时含不同类抗菌药物的粪便对土壤中的特定的菌群具有选择作用。
　　3.粪便污染对河流水中耐药基因和菌群结构的影响
　　研究了含有常用抗菌药物的猪粪污染河流水后，底泥和水样中四环素类耐药基因、磺胺类耐药基因和PMQR基因的发生和蓄积规律，同时分析了抗菌药物选择压力对底泥和水样中菌群结构的影响。我们将添加粪便和抗菌药物的水体作为处理组，包括四环素类药物处理组、磺胺类药物处理组和氟喹诺酮类药物处理组。只添加粪便的水体作为粪便组，未添加粪便和抗菌药物的水体作为空白对照组。底泥样品中，药物处理组的四环素类耐药基因（tetM、tetO、tetW、tetQ、tetX和tetS）、磺胺类耐药基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）的丰度分别是空白对照组的1.8～4.5倍、4.5～7.2倍和1.8～4.2倍。与空白对照组相比，处理组中的抗菌药物显著选择了很多特定的菌群，如四环素类药物显著选择底泥中的Salmonella、Escherichia/Shigella、Clostridium和 Stenotrophomonas。结果意味着含有抗菌药物的粪便对底泥和水样中绝大部分的ARGs具有显著的选择性，同时含抗菌药物的粪便显著选择了水体中的包括一些机会致病菌在内的特定菌群。
　　4.流溪河中耐药基因和菌群结构分析
　　实地调查了广州市粪源污染严重的流溪河中ARGs的丰度和菌群结构。我们采集了流溪河上游和下游的底泥和河水。大部分检测到的耐药基因（tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ、tetX、sul1、sul2、sul3、oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）的相对丰度在10-5至10-2之间，绝对拷贝数在102至108拷贝数/克或毫升。一些与机会致病菌相关联的菌属也有发现，如底泥和水样的所有样品中均检测到Acinetobacter、Clostridium和Arcobacter，其丰度分别高达29%、0.68%和0.58%。结果表明流溪河中ARGs污染较严重。在流溪河中发现的这些ARGs和与机会致病菌相关联的菌属给河流两岸的居民健康构成潜在的威胁。
　　5.全文结论
　　动物肠道是ARGs的存储库。未接触抗菌药物的肉鸡，其肠道中仍含有高丰度的ARGs。在正常的给药方案下，肉鸡暴露于金霉素的选择压力下，其肠道中的ARGs没有大幅度的显著性变化。肉鸡肠道中的ARGs以多药耐药基因为主，携带耐药基因的丰度最高的菌属是Escherichia。肉鸡肠道中发现的携带有ARGs的转座子、质粒和噬菌体可利于ARGs的横向传播。
　　动物粪便是ARGs向自然环境（农田和河流）传播的重要媒介。施粪土壤中四环素类耐药基因（tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ和tetX）、磺胺类耐药基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）丰度显著增加。但由粪便带入土壤中的不同ARGs的显著性在土壤中所维持的时间各不相同。粪便中含有的四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类抗菌药物都可延缓施粪土壤中对应ARGs的消减速度，对水环境中的底泥和水样中绝大部分的ARGs具有选择性。同时含抗菌药物的粪便显著选择了土壤和水环境中的包括一些与机会致病菌相关联的特定菌群。

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英文摘要

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第1章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的及意义

1.3 研究技术路线

第2章 鸡肠道耐药基因的排布规律

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4讨论

2.5 小结

第3章 粪便污染对土壤中抗生素耐药基因和菌群的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

3.5 小结

第4章 粪便污染对河流水中抗生素耐药基因和菌群的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

4.5 小结

第5章 实地调查流溪河中抗生素耐药基因污染和菌群结构

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与分析

5.4讨论

5.5 小结

第6章 全文讨论与结论

致谢

参考文献

附录A：发表文章及参加的相关学术会议

附录B: 攻读博士期间所获奖项

附录C: 英文综述