鸡羽毛降解菌株的分离鉴定及其发酵条件和降解效果的研究

摘要

羽毛是重要的蛋白质资源，其蛋白含量在80％以上，主要成分为角蛋白。但由于角蛋白是一种具有极强抗性，难以生物降解的硬蛋白，难以直接利用，而传统的物理和化学加工方法不仅消耗大量能源，还引发严重的二次污染问题。目前我国养殖业中每年产生百万余吨羽毛废弃物，且其数量还将增长，随着蛋白资源紧缺程度的加剧和我国经济的发展，亟需实现废弃角蛋白的高值转化和循环利用，而微生物降解羽毛角蛋白既能对羽毛废弃物进行无害化处理，又能实现角蛋白资源的转化利用，从而实现羽毛废弃物的变废为宝，这将产生巨大的生态效益和经济效益。
　　本研究首先采用以酪蛋白为唯一碳氮源的筛选培养基和以羽毛为唯一碳氮源的发酵培养基对能够降解羽毛的细菌进行初筛和复筛，以筛选培养基中酪蛋白降解圈和发酵培养基中羽毛是否降解作为判定依据，从下水道、掩埋家禽尸体的泥土、花坛、鱼塘等环境中分离和筛选出八株能高效降解羽毛的菌株：F-T1-2、X1、D1、T1、T3、Y2、T2、B1-2。通过形态学观察、生化鉴定试验和16S rDNA序列测定及系统发育分析，最终判定：F-T1-2、T1、T3为蜡样芽胞杆菌，X1、D1为甜菜假单胞菌，Y2、T2为嗜麦芽寡养单胞菌，B1-2为铜绿假单胞菌。并测得各菌株发酵降解羽毛24 h发酵上清液粗酶液的角蛋白酶酶活力为T1：49.9 U/mL，T3：34.3 U/mL，F-T1-2：32.05 U/mL，D1：23.1 U/mL，X1：35.6 U/mL，Y2：35.45 U/mL，T2：28.65 U/mL。迄今为止，国内外暂无甜菜假单胞菌、国内暂无铜绿假单胞菌降解角蛋白的报道，本研究为首次报道。
　　以1%的羽毛为底物，测定菌株D1、T2、Y2、T3、B1-2、F-T1-2对羽毛的降解效率，进行了发酵条件的初步优化，确定最佳发酵初始pH值分别为：D1和T2为pH=10，T3和B1-2为pH=11，Y2为pH=9，F-T1-2为pH=7；最佳发酵培养温度分别为：D1和T2为27℃，F-T1-2、B1-2和Y2为37℃，T3为32℃。
　　通过肉眼观察各菌株降解羽毛过程中羽毛结构变化和发酵液性状变化，并对F-T1-2降解的羽毛进行分时取样和扫描电镜观察。肉眼观察和电镜扫描显示发酵24 h时，部分羽小枝脱落，部分羽枝脱落，羽毛梗表面鳞片结构开始脱落；发酵48 h时，大部分羽小枝断裂脱落，大部分羽枝脱落，羽毛梗鳞片下纤维结构暴露；发酵72 h，羽枝剧烈断裂，羽小枝几乎消失，羽毛梗纤维撕裂、凹陷，羽毛梗内部蜂巢结构暴露；发酵192 h，羽枝和羽小枝已完全降解，羽毛梗断裂、分离，内部蜂巢结构完全暴露并开始溶解；发酵液随着发酵时间延长变得褐色浑浊。因此推断羽毛各部位的降解速度和容易程度顺序为：羽小枝>羽枝>羽毛梗；简要概括羽毛的降解过程为：羽毛降解菌附着→羽小枝完全降解→羽枝完全降解→羽毛梗完全降解。
　　本研究分离获得了八株高效的羽毛角蛋白降解菌，丰富了角蛋白降解菌的研究内容，为将来规模化的羽毛降解、大量的角蛋白酶生产纯化，甚至为重组基因工程菌株、构建高效生产菌株、开发新型蛋白酶品种打下基础。

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目录

1 前言

1.1 羽毛及角蛋白的结构与特性

1.2 角蛋白降解菌的分类

1.3 角蛋白酶的分类

1.4 角蛋白的降解机制

1.5 羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴定方法

1.6本研究的目的与意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 羽毛降解菌的分离、筛选和角蛋白酶酶活力测定

2.3 羽毛降解菌的菌种鉴定

2.4 羽毛降解菌发酵条件的研究

2.5 羽毛降解效果的研究

3 结果与分析

3.1 筛选结果

3.2 菌种鉴定结果

3.3 羽毛降解菌发酵条件的研究结果

3.4 发酵过程中羽毛的降解效果

4 讨论

4.1 羽毛降解菌株的分离与鉴定

4.2 培养条件对羽毛降解的影响

4.3 角蛋白降解菌降解羽毛的效果

5 结论

致谢

参考文献

附录:各分离菌株的16S rDNA序列