弓形虫RH株ROP18重组犬Ⅱ型腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫研究

摘要

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由专性细胞内寄生的弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的呈世界范围分布的机会致病性人兽共患寄生虫病，WHO和FAO已将其列为值得全球关注的食源性寄生虫病。它给畜牧业造成巨大的经济损失的同时，也威胁着人类（特别是艾滋病病人、接受癌症治疗的病人及器官移植患者等）的生命安全，对世界公共卫生安全提出了严峻的挑战。由于目前仍没有安全、有效的药物根治弓形虫病，因此研制安全、有效的抗弓形虫病疫苗对于弓形虫病的预防具有重要意义。
　　病毒载体一般不具有返强的风险，不仅可增强疫苗的活性，还能在适宜的细胞系中培养出表达目的外源基因蛋白的高滴度的重组病毒。在之前的研究中，我们课题组构建表达弓形虫 ROP18蛋白的真核表达载体作为核酸疫苗免疫小鼠，结果显示此疫苗能够延长RH株攻击感染的小鼠的存活时间，但保护效力不太理想，因此，我们利用病毒载体代替真核表达载体，探寻重组病毒疫苗对小鼠是否具有更高效的保护效力。
　　本研究采用犬Ⅱ型腺病毒表达系统，构建了含有弓形虫RH株ROP18基因的重组腺病毒质粒（pPloy2-CAV-2-ΔE3-ROP18），将重组质粒转染入MDCK细胞进行重组病毒的包装，发现细胞出现明显的CPE病变，通过 IFA鉴定重组病毒确实能够特异性表达外源蛋白，成功获得了能够表达弓形虫 ROP18蛋白的复制型重组腺病毒（CAV-2-ROP18）。利用重组病毒对昆明小鼠进行肌肉注射接种，同时设置 CAV-2弱毒株阴性对照组、PBS阴性对照组和空白对照组，测定各组小鼠体内的免疫应答指标，评估重组病毒疫苗对小鼠的保护效力。
　　实验结果显示，CAV-2-ROP18免疫组小鼠机体产生了有效的抗弓形虫感染的体液免疫和细胞免疫反应：特异性IgG和IgG1抗体水平明显升高；脾淋巴细胞SI显著升高；淋巴细胞分泌了大量的IFN-γ、IL-2和少量的IL-4；细胞内的细胞因子 IFN-γ和TNF-α均上调；CD4+和CD8+T淋巴细胞发生活化，比率上升；显著提高RH株感染小鼠的存活率（40％）；显著降低PRU株感染小鼠脑内的包囊的个数（57.3%）。
　　综上可得，本研究获得的重组腺病毒疫苗（CAV-2-ROP18）在预防急性和慢性弓形虫病中有着巨大的发展潜力。

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第一章 引 言

1.1 弓形虫棒状体蛋白18（ROP18）的研究进展

1.2 研究背景

第二章 弓形虫RH株ROP18重组CAV-2载体的构建

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 CAV-2-ROP18重组病毒的获得与鉴定

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 CAV-2-ROP18重组病毒的免疫研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

全文结论

致谢

参考文献

附录A RH株ROP18测序结果

附录B pPloy2-CAV-2-ΔE3-ROP18重组病毒载体构建流程图

附录C 攻读硕士学位期间论文发表及获奖情况