真菌激发子促进蛹虫草类胡萝卜素生物合成的研究

摘要

蛹虫草具有免疫系统调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、镇静、催眠和调节内分泌系统等功效。新近研究表明蛹虫草含有稀少的水溶性类胡萝卜素，具有独特的生理价值。因此，对其所含类胡萝卜素的研究日益增多，但绝大部分仍处于提取、鉴定等阶段，而对如何提高类胡萝卜素的含量鲜有报道。本文通过优化发酵培养条件，添加天然激发子诱导等途径提高蛹虫草的类胡萝卜素含量，同时对激发子促进蛹虫草类胡萝卜素合成的机制进行研究。主要结果如下：
　　（1）以蛹虫草类胡萝卜素含量为指标，采用单因素与正交试验相结合的方法优化了蛹虫草固体发酵的实验条件，得到的最佳培养条件为大米培养基30 g，营养液蛋白胨浓度为1.5％，暗培养天数为6d，光照时间为8d。经验证，在此培养条件下，蛹虫草固体发酵后的类胡萝卜素含量可达309.54μg/g。
　　（2）以粘红酵母Rhodotorula glutinis、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、红曲霉Monascus rubber、三孢布拉霉Blakeslea trispora、金针菇Flammulina velutipes5种真菌作为激发子，考察对蛹虫草产类胡萝卜素的影响，结果表明粘红酵母在一个浓度下对蛹虫草类胡萝卜素含量有明显促进作用，提高了13.72%。其余真菌激发子对蛹虫草均无明显正向激发作用。
　　（3）以粘红酵母激发子为研究对象，考察粘红酵母培养时间、激发子的添加量和添加时间对蛹虫草类胡萝卜素含量的影响。结果表明，不同培养时间和激发子添加时间对类胡萝卜素的激发作用显著，而缩小浓度范围后，激发子浓度影响效果并不明显。最后结果显示84 h为粘红酵母最优发酵时间，比对照提高了38.19%，激发子最佳浓度为1.5 g/L，比对照提高了26.86%，最佳的添加时间5 d，比对照提高了47.44%。将粘红酵母激发子分离为三种组分，考察各组分的添加对对蛹虫草类胡萝卜素含量的影响，结果表明对类胡萝卜素有激发作用的有效组分应为去除了蛋白质和多糖的小分子物质Part O。
　　（4）通过构建蛹虫草基因组的本地blast数据库比对得到蛹虫草中圆酵母素加氧酶基因carT和醛脱氢酶carD基因的DNA序列，成功克隆测序并进行了序列的生物信息学分析。结果表明 carT基因蛋白质在蛹虫草和白僵菌中相当保守，并且该蛋白质在多种真菌中的表达都是高度同源的，表明其进化的频率并不高。而 carD基因在同源进化的过程中也是相当保守的，与白僵菌的氨基酸序列达到了百分百的同源，虽然在基因序列上有所差异，但尚不明确该差异在蛋白质结构上造成的影响。
　　（5）利用实时荧光定量PCR监测激发子对蛹虫草类胡萝卜素合成基因的影响，实验结果表明，3个基因均在光照后第6d达到最高表达量，而粘红酵母激发子对carT基因和carD基因均有明显的抑制效果，而对ggpps191基因整体效果并不明显，但是也会在光照后第6 d产生比较显著的抑制作用。

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1 前言

1.1 蛹虫草的研究现状

1.1.1 分类学地位

1.1.2 分布与寄主范围

1.1.3 主要成分与药理学作用

1.1.4 组学研究

1.1.5 产业化进展

1.2 真菌激发子的研究概况

1.2.1 真菌激发子

1.2.2 真菌激发子对蛹虫草的作用

1.2.3 真菌激发子对真菌产类胡萝卜素的影响

1.3 类胡萝卜素的研究现状

1.3.1 来源及分布

1.3.2 结构及分类

1.3.3 生理活性功能

1.3.4 生物合成途径

1.3.5 真菌类胡萝卜素

1.4 蛹虫草类胡萝卜素的研究现状

1.4.1 提取与性质鉴定

1.4.2 结构鉴定

1.4.3 光反应研究

1.5 本研究的目的及意义

1.6 技术路线

2 材料、设备与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种及质粒

2.1.2 工具酶和试剂

2.1.3 试剂配制

2.1.4 培养基

2.1.5 引物

2.2 实验设备

2.3 试验方法

2.3.1 蛹虫草固体发酵条件的优化

2.3.2 真菌激发子的激发试验

2.3.3 蛹虫草类胡萝卜素合成基因carT、carD的克隆及序列分析

2.3.4 真菌激发子对蛹虫草类胡萝卜素相关基因表达量的影响

3 结果与分析

3.1 培养条件的优化

3.1.1 总类胡萝卜素全波长扫描结果

3.1.2 蛹虫草培养条件优化

3.2 真菌激发子的激发试验

3.2.1 不同真菌激发子的对蛹虫草类胡萝卜素的影响

3.2.2 不同激发条件对蛹虫草类胡萝卜素的影响

3.2.3 粘红酵母激发子各组分对蛹虫草类胡萝卜素的激发作用

3.3 蛹虫草类胡萝卜素合成相关基因carT、carD的克隆及序列分析

3.3.1 蛹虫草总DNA的提取

3.3.2 圆酵母素加氧酶基因carT的克隆及序列分析

3.3.3 醛脱氢酶carD基因的克隆及序列分析

3.4 利用实时荧光定量PCR检测蛹虫草类胡萝卜素相关基因的表达量

3.4.1 总RNA提取结果

3.4.2 荧光定量引物设计的合理性检验结果

3.4.3 荧光定量PCR方法的特异性检验

3.4.4 标准曲线的建立

3.4.5添加粘红酵母激发子对carT、carD、ggpps 191基因的表达量的影响

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 蛹虫草培养中的退化问题

4.1.2 蛹虫草类胡萝卜素合成途径探讨

4.1.3 激发子对合成次生代谢产物的调控机制探讨

4.2.4 类胡萝卜素代谢调控

4.2 结论

致谢

参考文献

附录