携带不同NA基因的H5亚型禽流感病毒生物学特性研究

摘要

为了解NA基因对H5Nx亚型AIV（Avian influenza virus）生物学特性的影响，以一株鹅源的H5N1亚型禽流感病毒A/goose/Guangdong/SH7/2013（H5N1），简称SH7株为载体，利用反向遗传操作技术，分别替换A/chicken/Hebei/LZF/2014（H5N2）、A/duck/Guangdong/673/2014（H5N6）、A/goose/Guangdong/674/2014（H5N6）和A/goose/Guangdong/Js1306/2014（H5N8）等毒株NA，拯救获得亲本株rSH7（H5N1）和4株具有不同NA的H5亚型重组AIVs，分别为rSH7-LZFNA（H5N2）、rSH7-673NA（H5N6）、rSH7-674NA（H5N6）和rSH7-Js1306NA（H5N8）。其中，SH7毒株HA来自2.3.4.4分支，rSH7-674NA毒株NA茎部第58-68位缺失11个氨基酸，是短茎N6，而rSH7-673NA毒株NA则不存在上述现象，是长茎N6。分别以105EID50剂量的病毒感染BALB/c小鼠，结果表明替换不同NA的H5亚型禽流感病毒对小鼠的致病性差异显著，rSH7、rSH7-Js1306NA和rSH7-673NA为高致病性，均能在低剂量水平致死小鼠，MLD50分别是2.5、2.5和2.68 lgEID50；rSH7-674NA为中等致病性，可在较中等剂量致死小鼠，MLD50为3.16 lgEID50；rSH7-LZFNA呈现低致病性，只能在最高剂量致死小鼠，MLD50为3.3 lgEID50。而对SPF鸡致病性试验证实不同NA的H5亚型AIV接触传播能力差异显著，105EID50剂量攻毒，各组同居动物死亡率分别为rSH7（100％）、rSH7-673NA（100%）、rSH7-674NA（85.7%）、rSH7-Js1306NA（71%）和rSH7-LZFNA（57%），由大到小依次是N1、N6、N8和N2，与1996-2015年我国各地区H5亚型AIV毒株分布统计数据相符：H5N1亚型AIV在全国范围分布广泛，H5N2亚型AIV分布局限，新近采集的临床样品中H5N6亚型AIV分离率高且具有感染人的威胁，H5N8亚型AIV对家禽存在极大的潜在风险。
　　结合体内试验结果，本研究探索NA影响H5亚型AIV生物学特性的分子机制。首先，测定了5株重组病毒在CEF、DF1和MDCK中的增殖情况，发现CEF中各病毒滴度差异不显著，DF1中N2亚型的病毒滴度低，MDCK中病毒滴度由高到低依次是N8、短茎N6、N1、长茎N6和N2。上述结果与测定的小鼠MLD50基本吻合，说明NA可能通过增强病毒在哺乳动物细胞中复制能力从而增强对哺乳动物模型小鼠的致病力。其次，针对NA的功能，测定了病毒NA酶活性，从高到低依次是N8、N2、N1、短茎 N6和长茎 N6，而病毒对豚鼠红细胞的解凝能力结果表明长茎 N6、N8与本研究中选取的2.3.4.4分支HA匹配性最强。为了更直观的观测NA对病毒复制能力的影响，还测定了病毒在MDCK中形成蚀斑的大小，由大到小依次是N8、短茎N6、长茎N6、N1和N2，综合上述结果，NA功能的发挥可能与NA酶活性有关，但NA酶活性不是其决定因素；短茎 NA能增强在哺乳动物细胞上的复制能力；此外，NA发挥作用还与HA的匹配性有关。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 2014-2015年2.3.4.4进化分支H5Nx亚型AIV感染情况概述

1.3 NA在AIV传播中的角色

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 毒株

2.2 鸡胚及实验动物

2.3 细胞

2.4 主要试剂

2.5 主要仪器

2.6 SH7株反向遗传系统及部分毒株NA片段的构建

2.7 H5Nx重组病毒体外试验

2.8 病毒对SPF鸡的致病性

2.9 病毒对SPF BALB/c小鼠的致病性

3 结果与分析

3.1 5株H5Nx亚型AIVs的拯救与传代结果

3.2 5株H5Nx亚型AIVs蚀斑大小测定情况

3.3 5株H5Nx亚型AIVs豚鼠红细胞解凝试验结果

3.4 5株H5Nx亚型AIVs的NA酶活性测定结果

3.5 5株H5Nx亚型AIVs在CEF、DF1和MDCK生长曲线测定

3.6 病毒对SPF鸡致病性测定

3.7 病毒对SPF BALB/c小鼠的致病性测定

4 讨论

4.1 5株H5Nx亚型AIVs在体外试验讨论

4.2 5株H5Nx亚型AIVs在体内试验讨论

全文总结

致谢

参考文献

附录A

附录B