同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP快速检测试剂盒

摘要

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP引物组、试剂盒。发明人基于GeXP系统研究设计了6对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP试剂盒。应用本发明可同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型，灵敏度为102拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H5亚型禽流 感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，同时某些亚型禽流 感病毒也能感染人类。禽流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨 酸酶(NA)的抗原关系差异，可将其分为16种HA亚型和9种NA亚型。根 据其致病性可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括 H5和H7亚型。特别是近年来频繁爆发的H5亚型禽流感疫情给许多国家和 地区的养禽业带造成了巨大的经济损失。2003年以来，H5N1亚型禽流感病 毒疫情已经从亚洲逐步蔓延至欧洲以及非洲在内的共计56个国家和地区。 2014以来，中国的黑龙江、江苏和湖南等省先后发生家禽感染H5N6亚型禽 流感病毒的疫情，韩国、日本、荷兰、英国、德国、美国和中国台湾等地区 相继出现H5N8禽流感疫情，还有2015年在美国爆发的H5N2亚型禽流感疫 情，上述疫情均造成大量家禽死亡和被扑杀。此外，H5N1亚型和H5N6亚型 AIV可以直接感染人并引起死亡的事件提示H5亚型AIV不仅给养禽业造成 巨大经济损失，还可以跨越宿主种属屏障直接感染人进而危及人类安全。

目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学 试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流 感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使 用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周 期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。虽然多重PCR 有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检 验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的 特性、引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导 致样品扩增效率不一致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表 达分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplexreverse transcription-polymerasechainreaction,mRT-PCR)是由通用引物(上游加荧光 标记)和特异性嵌合引物(基因特异性引物5'末端连接通用引物序列)相结 合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服 普通多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进 行产物的分离，大大提高了检测结果的灵敏度和可靠性。目前，GeXP技术已 经运用到新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒，手足口病病原，常见呼 吸道病病原及HPV病毒等感染人类病原的检测与分型，本实验室也已经成功 建立了同时检测鸡九种呼吸道疾病病原体的GeXP方法。

由于不同NA亚型的H5AI的爆发都具有发病急、传播速度快、临床症 状相似及死亡率高等共同特点，现有的的诊断技术又很难在较短时间内对其 作出准确的判定，不利于其防控及应急措施的制订。目前，检测H5亚型AIV 的核酸检测方法多是针对其HA基因，同时检测H5、N1、N2、N6和N8基 因并进行分型的技术尚未见有报道。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时 对H5亚型禽流感病毒的四种不同NA亚型进行检测和分型，达到快速鉴别目 前对养禽业危害最大的H5N1、H5N2、H5N6和H5N84种组合禽流感病毒的 目的，对H5亚型禽流感的流行病学调查及其防控，保障养禽业的健康持续发 展具有重要意义。

本发明要解决的技术问题是提供一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其 四种不同NA亚型的GeXP引物组、试剂盒及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP引物组， 包括6对特异性引物，分别是引物对A1和A2、引物对B1和B2、引物对C1 和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E1、引物对F1和F2，其分别具有如 SEQIDNo.1至SEQIDNo.12所示的序列。

一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP试剂盒， 包括cDNA、10×PCRbuffer、MgCl₂、dNTP、JumpstartTaqpolymerase、6对 特异性引物、1对通用引物和RNA-free水，所述的6对特异性引物、1对通 用引物分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.14所示的序列。

作为优选，所述的6对特异性引物A1和A2、引物对B1和B2、引物对 C1和C2、引物对D1和D2、引物对E1和E2、引物对F1和F2在PCR反应 体系中对应的的摩尔浓度分别为100nmol/L、50nmol/L、50nmol/L、150 nmol/L、100nmol/L、100nmol/L；所述的通用引物Cy5-Tag-F、Tag-R在PCR 反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。

作为优选，所述的试剂盒总体积为25μL/管，其中包含：cDNA2.0μL， 10×PCRbuffer2.5μL，MgCl₂2.5μL，dNTP1μL，JumpstartTaqpolymerase1.2 μL，6对特异性引物混合物1.25μL，上、下游通用引物混合物1.25μL，RNA-free 水补足至25μL。

本发明还提供了所述的同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚 型的GeXP引物组或所述的同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚 型的GeXP试剂盒在鉴别H5N1、H5N2、H5N6和H5N8亚型禽流感病毒中的 应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立了一种能同时 检测M、H5、N1、N2、N6和N86个基因的禽流感病毒多重逆转录－聚合酶 链反应(mRT-PCR)方法。首先对反应条件和多重反应体系进行优化，然后 分别用已验证的阳性模板对多重PCR体系进行特异性验证。多重检测体系可 以同时检测出H5亚型禽流感病毒4种不同NA亚型，灵敏度为10²拷贝/μL。 该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5亚型禽流感病 毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

2.本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5亚型禽流感病毒的 四种不同NA亚型进行检测和分型，达到快速鉴别目前对养禽业危害最大的 H5N1、H5N2、H5N6和H5N84种组合禽流感病毒的目的，对H5亚型禽流 感的流行病学调查及其防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。

附图说明

图1为GeXP多重PCR的毛细管电泳分析图；

图2为对临床单一感染H5N1亚型禽流感病毒的检测结果；

有关附图标记的说明：

横坐标-PCR扩增产物的碱基数；纵坐标-荧光信号值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施 方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用 于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可 以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限 定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实 施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施 例中所使用的禽流感毒株及其他禽类病毒参考株均由广西壮族自治区兽医研 究所保存。

实施例1：禽流感病毒多重RT-PCR引物设计

参考相关文献从GenBank数据库中下载禽流感病毒M、H5、N1、N2、 N6和N86个基因的序列，利用DNAStar分别对各个基因核苷酸序列进行分 析和比较，寻找出适合设计特异性引物的保守区域，利用GeXPexpressprofiler 工具设计针对禽流感病毒6个基因的特异性引物(见表1)，设计好的引物采 用PrimerPremier5.0、NCBIPrimerBlast和Oligo7.0进行分析和筛选，然后在 全部正向引物和反向引物的5'端分别加入一段非同源性独特序列作为通用引 物(Uni-Primer)，上游通用引物5'端标记荧光染料Cy5，即Cy5-Tag-F，由上海 Invitrogen公司合成，HPLC纯化。

表1引物信息

表1中，兼并碱基代码R＝A/G，D＝A/G/T,Y＝C/T，下划线表示的是上、 下游通用引物序列；荧光染料Cy5标记上游通用引物标签,下游引物不标记。 根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统(如GenomeLabTMGeXP GeneticAnalysisSystem毛细管电泳仪)的误差，使用上述引物对A-F及GeXP 通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上 下波动3bp。

实施例2：多重PCR检测体系的建立

2.1模板及含靶基因的单克隆质粒标准品的制备

按照TaKaRa公司MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0(目录 号DV819A)说明书从提取不同亚型(H1-16和N1-9)禽流感病毒和其他禽 类病毒的核酸，获得50μL的核酸样品，分装置于-80℃保存。RT反应体系参 照TaKaRa公司逆转录酶(目录编号D2639A)说明书进行，将获得的RNA样品 分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作 为总RNA的对照。

反应体系(25μL)：5×ReverseTranscriptaseBuffer5μL,50mmol/LRandom Primer(9mer)1μL、dNTPMixture(10mM/L)2μL,40URibonucleaseInhibitor 0.5μL,5U/μLMLVReverseTranscriptase0.5μL，模板RNA1μg，RNA-free水 补足至25μL。

反转录温度42℃1.5h，置于-20℃保存。用PCR分别扩增含有M、H5、 N1、N2、N6和N86个目的基因区域的片段，扩增后得到的的PCR阳性产物 克隆到T-easy载体中构建成质粒，经测序证实这6个重组质粒为T-easy载体 分别插入了一种上述基因的重组质粒，且分别为上述6对引物对A-F的靶基 因。

2.2使用单重RT-PCR法验证引物

2.2.1单重特异性引物(SP-Primer)稀释至工作浓度1μmol/L，Cy5-Tag-F 和Tag-R稀释至工作浓度10μmol/L。

反应总体积为25μL，体系组分为：cDNA2.0μL，10×PCRbuffer2.5μL， MgCl₂(25mM/L)2.5μL，SingaJumpstartTaqpolymerase1.2μL(2.5U/μL)(Singa 公司，目录号：D4184)，dNTP(10mM/L)1μL(TaKaRa公司，目录号:D4030RA)， 特异性引物混合物取1.25μL，上、下游通用引物混合物取1.25μL，最后用 RNA-free水补足25μL。

反应条件为：94℃5min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环； 94℃30s，65℃30s，10个循环；94℃30s，53℃30s，72℃30s，20个循环； 72℃延伸3min，置于4℃。

2.2.2毛细管电泳

使用GenomeLabGeXP遗传分析系统的各PCR产物同时进行毛细管电泳 检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液(美国贝克曼库尔特公司,目录 编号608082)，DNAsizestandardKit-400BasePairs(美国贝克曼库尔特公司, 目录编号608098)与上样缓冲液按体积比1:(80-160)彻底混匀，在样品板 上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后 的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免 甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电 泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注 入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLabGeXP遗传分 析系统确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。

2.2.3引物对A-F的单重特异性检测

用引物对A-F分别扩增实施例1中获得的cDNA样品：用引物对A扩增 H5N1，引物对B扩增H5N1,引物对C扩增H5N1，引物对D扩增H9N2，引 物对E扩增H6N6，引物对F扩增H6N8。PCR扩增和毛细管电泳的结果显示 单重特异性引物只对靶基因有良好扩增且未见有杂峰。不同靶基因片段扩增 后的大小范围为：AIVM,210-213bp；AIV-H5,223-226bp；AIV-N1,160-163bp； AIV-N2,188-191bp；AIV-N6,240-243bp；AIV-N8,280-283bp。

2.3GeXP多重PCR体系的建立

将引物对A、B、C、D、E和F混合成多重混合引物(Mix-Primer)工作 液，通过对引物浓度的优化，使靶基因M、H5、N1、N2、N6和N8的引物 在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为100nmol/L，50nmol/L，50 nmol/L，150nmol/L，100nmol/L，100nmol/L；通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R 在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。其余成分与引物验证的相同。 以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板或多种病原的混合cDNA样品 作为模板，进行多引物PCR反应，反应程序及电泳与引物验证的相同。

2.4结果

6对引物对A-I混合后分别对单一cDNA或混合cDNA进行检测。

如图1所示，结果表明多引物单模版分别检出了210bp、223bp、162bp、 188bp、240bp、280bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物；多引物多模板 结果表明6个靶基因可被同时检出，经GeXPsystem多重检测体系分析，可 检出与实际相符的6个目的峰且无其他杂峰，同时可通过产物片段大小来区 分所检测的H5亚型禽流感病毒的四个不同NA亚型。结果也验证了多重检测 检测体系中的引物特异性。

实施例3：GeXPsystem多重检测体系特异性检测

按照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0说明书从尿囊液中 分别提取HA(1-16)和NA(1-9)亚型禽流感病毒核酸，同时提取IBV、NDV 和ILTV等禽类常见病毒的核酸分别加入到实施例2建立的GeXP多重检测体 系中，检测该方法的特异性。多重PCR完成后，PCR产物上机进行GeXP毛 细管电泳分析，结果显示每个反应只出现特异信号，无交叉反应。HA基因除 H5亚型，NA基因除N1、N2、N6和N8亚型外的其他NA亚型，以及NDV、 IBV、ILTV和空白对照均无反应信号，提示所建立的方法特异性强，与其他 检测对象无交叉反应。

实施例4：GeXPsystem多重检测体系的灵敏度试验和检测临床样本能力 的分析

4.1GeXPsystem多重检测体系的灵敏度试验

用Promega公司RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7试剂 盒(目录号P1300)按其说明书分别使用SpeI和PvuII对实时例2中构建的含 有M、H5、N1、N2、N6和N8基因的质粒进行酶切，将上述6个含有不同 目的基因线性化质粒进行体外转录合成RNA。利用DU800UV/Vis分光光度 计对体外转录RNA浓度进行测定和定量。根据核酸浓度和分子量计算RNA 的拷贝数。将M、H5、N1、N2、N6和N8基因的体外转录RNA等比例混合 后进行10倍连续稀释至10⁶-10拷贝/μL。以稀释产物为待检测样品，以实施 例2建立的方法进行GeXP多重检测体系灵敏度的检测与分析。试验在不同 日重复3次。

非同日的3次重复试验表明，该方法对于H5、M、N1、N2、N6和N8 基因最低可以检测至100拷贝/μL的核酸样本。

4.2GeXPsystem多重检测体系检测临床样本的能力

从实施例1随机选择H5N1亚型禽流感病毒的cDNA，经实施例2中步骤 二的方法进行检测。H5N1亚型禽流感病毒的检测结果如图2,可以同时检测 出162.46、210.60和224.86三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有 H5N1亚型禽流感病毒的模板，与实际相符。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。