对我国2012～2015年部分地区鸡AIV H9N2流行株的流行变异及抗原性研究

摘要

中国大陆于1994年在广东省首次报道并分离得到H9N2亚型禽流感病毒，随后该亚型病毒广泛传播至我国大部分省区。近年来，关于H9N2亚型禽流感病毒的分离报道呈持续上升态势，该病的流行每年都给我国养禽业带来巨大经济损失。同时H9N2亚型禽流感病毒还可以为新出现感染人的H7N9、H10N8亚型禽流感病毒提供内部基因，潜在威胁人类健康安全，具有重要的经济和公共卫生意义。
　　为弄清H9N2病毒在我国的流行变异情况，本研究对2012～2015年分离到的42株H9N2亚型AIV进行全基因组测序和遗传进化树构建，并选取其中的18株代表株制备单因子血清，进行交叉HI试验，以此来研究H9N2流行株之间的抗原性分化情况，最后用免疫保护实验，评价毒株Ck/GX/SIC6/13对流行株的免疫保护效果。
　　遗传进化分析表明：42株H9N2病毒均属于Ck/Bei-like分支（h9.4.2），其中97.6％（41/42）的分离株属于h9.4.2.5亚分支，2.4%（1/42）的分离株属于h9.4.2.6亚分支，其HA基因之间的核苷酸相似性为86.7%~99.7%，与经典疫苗株的相似性为88.6%~92.6%。分离株形成4种不同的重组基因型（S，U，V，W），基因型S是流行的主基因型，占研究毒株的92.8%（39/42）；基因型V、W为新重组基因型，其中基因型V和基因型W分别整合了来源于G9-like谱系的NA基因和wild waterfowl-like谱系的PB2基因，使H9N2病毒的基因重组现象愈加复杂化。
　　特定氨基酸位点分析表明：所有分离株的HA蛋白裂解位点有两种模式，分别为PSRSSR↓GLF（97.6%，41/42)和PARSSR↓GLF（2.4%，1/42），没有多个连续碱性氨基酸插入，均符合低致病性禽流感病毒的分子特征。部分毒株的HA受体结合位点模式与人流感病毒受体结合位点类似，92.8%（39/42）的毒株在HA蛋白上出现了与哺乳动物适应性相关的Q226→L突变；95.2%（40/42）的病毒在NA茎部出现了与毒力增强相关的63-65位点三个氨基酸缺失；97.6%（41/42）的毒株M2蛋白发生了与金刚烷等药物耐药性相关的S31→N突变；本研究分离株中仅有2.4%（1/42）的毒株在PB2基因中出现E627→K，没有D701→N突变出现。
　　交叉HI试验结果表明：18株新分离株单因子抗血清对于相同和不同病毒抗原的HI效价差异为0~9 log2，它们之间的抗原相关性R值为0.41~1，说明即使来源同一分支的H9N2亚型AIV，其抗原性也正在逐渐分化，抗原性差异各异的流行株同时存在给该病的防控带来困难。本研究根据遗传进化树和交叉HI实验结果，将18株新分离株分为3个抗原群（A、B、C），结合HA基因进化分支和毒株分离时间及地点等因素，3个抗原群的出现大致呈现出A→B→C的先后关系。
　　免疫保护实验表明：H9N2早期分离株制备的灭活疫苗对现今H9N2流行毒株不能起到有效保护，对A群病毒的保护率仅为30%~50%；毒株Ck/GX/SIC6/13制备的灭活疫苗也只能保护本毒株的攻毒，保护率为90%，而对其余毒株的保护效果均不理想，提示近年H9N2流行毒株的流行变异较为频繁，流行株之间的抗原性复杂、交叉保护力差。

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1 引言

1.1 禽流感概述

1.2 AIV H9N2亚型在我国的流行情况

1.3 AIV H9N2亚型基因重组现状

1.4 AIV H9N2亚型的疫苗防控

1.5 潜在的公共卫生风险

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 病毒的分离鉴定与RT-PCR扩增

2.3 H9N2亚型AIV全基因组测定及遗传进化分析

2.4 H9N2亚型AIV分离株抗原性分析

2.5 免疫保护实验

3 结果与分析

3.1 H9N2亚型AIV的流行分布情况

3.2 HA基因

3.3 NA基因

3.4 内部基因

3.5 重组基因型划分结果

3.6 抗原性分析结果

3.7 免疫保护实验结果

4 讨论

4.1 H9N2亚型AIV的流行趋势

4.2 表面基因的变异情况

4.3 内部基因特定氨基酸位点

4.4 内部基因的基因重组情况

4.5 抗原性分析

4.6 免疫保护实验

5 结论

致谢

参考文献