定点改造的猪源胰高血糖素样肽-2在植物乳杆菌中的表达及生物活性研究

摘要

在养殖生产过程中，仔猪在断奶期由于各种因素应激，导致仔猪肠道形态和结构出现不同程度的破坏，导致食欲不振、腹泻、生长停滞等所谓的“断奶仔猪应激综合征”，严重影响仔猪的健康和养殖效益。GLP-2是一种特异性肠道营养因子，在特异性地促进肠上皮细胞的增殖、减轻肠细胞的凋亡和损伤、维持肠道黏膜的完整性方面发挥着重要的作用。但肠道内的二酰肽酶 IV(Ddipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)对完整的GLP-2第二位的丙氨酸的酶切，致使GLP-2的半衰期很短。因此，本研究对猪源胰高血糖素样肽2（pGLP-2）基因进行氨基酸定点改造，将 GLP-2的第二位的丙氨酸替换成甘氨酸，形成不被 DPP-IV酶切的p(Gly2)-GLP-2，并进行植物乳杆菌(Lp1)的密码子偏嗜性修饰，克隆至由超强启动子SCP驱动外源基因表达的植物乳杆菌表达载体pSCPSP，成功构建了表达载体 pSCPSP-p(Gly2)-GLP-2，将质粒电转化入植物乳杆菌 LP1。通过基因组 PCR方法鉴定后获得阳性重组转化子pSCPSP-p(Gly2)-GLP-2-LP1，将24 h培养上清进行Tricine-SDS-PAGE检测目的条带，可观察到4 KD左右目的条带。并用pGLP-2 ELISA特异性检测试剂盒检测24 h、36 h、48 h时间培养上清中目的蛋白的含量，结果显示随着时间增加，表达量呈下降趋势，最后确定最佳表达时间为24 h。为验证本试验表达的p(Gly2)-GLP-2的体内生物活性，建立由DSS诱导的小鼠慢性结肠炎模型后，进行对比治疗试验。表达的p(Gly2)-GLP-2在小鼠肠炎模型试验中表现出良好的生物活性。本试验成功构建的由超强启动子 SCP组成的表达系统成功在植物乳酸杆菌中表达了改造后的p(Gly2)-GLP-2，在小鼠体内外具有良好的生物活性，为养殖生产中解决仔猪断奶应激综合症提供理论依据和技术手段。

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1 引言

1.1 我国养猪业中仔猪肠道问题综述

1.2 胰高血糖素样肽-2的研究综述

1.3 乳酸菌表达系统综述

1.4 本研究的目的和意义及其创新性

第一部分 植物乳杆菌表达系统的构建

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第二部分 重组乳杆菌pSCP-p(Gly2)-GLP-2-LP1的生物学活性分析

1. DSS诱导的小鼠慢性结肠炎模型的建立

2. 重组乳杆菌pSCP-p(Gly2)-GLP-2-LP1对肠炎模型的治疗试验

3. 结果

第三部分 分析讨论及全文总结

1. 分析讨论

2. 全文总结

致谢

参考文献

附录：pIAβ8质粒图谱