烟粉虱丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin的克隆、原核表达及表达分析

摘要

烟粉虱（Bemisia tabaci）的寄主范围广泛，对化学农药抗性较强，是世界重大入侵害虫之一，对农业生产造成巨大损失。丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin负调控蛋白酶介导的一系列生命进程，在昆虫中主要起到抑制过度黑化反应的作用，在昆虫的先天免疫反应中起到重要作用。为了基于烟粉虱的免疫系统，阐明免疫相关基因的结构与功能，并且研制以免疫通路为靶标的新型农药来防治烟粉虱。本研究用分子生物学技术，根据烟粉虱转录组数据，对预测为putative serine protease inhibitor4的Unigene CL1572.Contig3_B序列，通过RT-PCR结合RACE技术克隆获得cDNA全长。应用荧光定量 PCR技术研究了 Serpin基因在烟粉虱中的龄期表达特异性，并以大肠杆菌（Escherichia coli）为载体，在体外进行了原核表达。
　　主要研究结果如下：
　　1、利用reverse transcription PCR(RT-PCR)和rapid amplification of cDNA ends(RACE)技术，对烟粉虱转录组数据预测的Serpin基因unigene片段进行克隆，获得了烟粉虱Serpin基因的cDNA全长。并将全长序列上传GenBank数据库，登录号为No. KT326952。Serpin的cDNA全长为1899 bp，开放阅读框（ORF）为1206bp，共编码401个氨基酸，将预测编码的氨基酸序列与其他昆虫的Serpin氨基酸序列进行比对并构建系统发育树，发现它们与同为半翅目的柑橘木虱（Diaphorina citri）和褐飞虱（Nilaparvata lugens）有较高的同源性。
　　2、为阐明烟粉虱Serpin基因在核酸水平上的表达模式，本研究通过real time quantity PCR(qRT-PCR)检测其在卵、若虫、成虫的相对表达量。结果显示，Serpin基因在烟粉虱的所有龄期都有表达。在卵期和成虫期表达量显著高于其他龄期；在4龄若虫表达量显著低于其他龄期。结果表明，Serpin在烟粉虱中具有龄期表达特异性。
　　3、本实验构建了原核表达载体pET-32a-Serpin，在大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导大量表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明pET-32a-Serpin表达相对分子质量约为45kDa的蛋白。用Ni-NTA亲合层析和胶回收纯化了Serpin蛋白，为Serpin蛋白的结构和功能研究提供了蛋白资源。用纯化的蛋白免疫动物，制备了多克隆抗体，以制备的多克隆抗体进行Western blot检测，揭示了Serpin在蛋白水平上的龄期表达模式，验证了qRT-PCR的结果。

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1 前言

1.1 烟粉虱的入侵和危害

1.2 Serpin家族及其在昆虫中的功能

1.3 昆虫天然免疫反应简介

1.4 本研究的目的与意义

2 实验材料

2.1 供试材料

2.2 实验仪器

2.3 主要培养基：

2.4 主要试剂的配制

3. 实验方法

3.1 烟粉虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆

3.2 BtSerpin基因的表达模式研究

3.3 原核表达及抗血清的制备

4 实验结果与分析

4.1 Serpin已知序列的扩增

4.2 Serpin全长序列的获得

4.3 Serpin基因的龄期表达模式分析

4.4 pET-32a-Serpin重组表达载体的构建与原核表达

5. 讨论与结论

5.1 结论

5.2 讨论

5.3 需要进一步研究的问题

5.4 本研究的创新点

致谢

参考文献

附录