美丽硬仆骨舌鱼Raf激酶基因的克隆、组织表达及原核表达分析

摘要

[目的]Raf激酶是调控细胞增殖、分泌和运动的重要蛋白激酶,参与多种生命活动.研究Raf激酶基因(raf)的结构特征和表达模式,以探究其在美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)中的功能.[方法]研究通过RACE技术克隆了美丽硬仆骨舌鱼raf基因cDNA序列(GenBank登录号MW679580)并进行生物信息学分析;用荧光定量PCR检测raf在精巢等8个组织内的表达模式;通过构建原核表达载体诱导美丽硬仆骨舌鱼raf融合蛋白.[结果]美丽硬仆骨舌鱼raf序列全长3747 bp,开放阅读框(ORF)为1827 bp,编码609个氨基酸.生物信息学分析显示,Raf蛋白的分子量为68.8 ku,等电点PI为9.45,含有1个Ras结合域,1个蛋白激酶C保守区(C1)结构域,1个低合成复杂度区域和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域,是亲水性跨膜蛋白.序列同源性分析显示,美丽硬仆骨舌鱼raf编码蛋白序列与雀鳝相似度最高,为84.28％.美丽硬仆骨舌鱼与雀鳝都是较早分化出的物种,序列同源性分析与两者进化地位相符.用荧光定量PCR检测raf在8个组织内的表达量,结果表明,raf基因在美丽硬仆骨舌鱼多种组织中均有表达,其中在精巢和肝中的表达量最高,其次是脾和头肾.精巢和肝中的表达量显著高于卵巢、鳃、心脏和脑组织(P<0.05).构建pET-B2m-raf原核表达载体,通过0.1 mmol/L IPTG诱导,成功获得融合蛋白,经SDS-PAGE检测,其分子量符合预期.[结论]raf在美丽硬仆骨舌鱼精巢和肝脏中的表达量较高,推测其可能在精巢发育和免疫机能调控中发挥作用,构建原核表达载体并成功诱导出重组蛋白,为进一步研究raf在美丽硬仆骨舌鱼体内的生物功能奠定基础.