家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Serpin-6的原核表达

摘要

为了研究家蚕（Bombyx mori）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Serpin-6)在大肠杆菌中的表达情况，本研究将获得的家蚕Serpin-6基因去信号肽后，设计两对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物，对cDNA编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增，并与经过同样双酶切的pET-28a(+)构建原核表达载体。重组质粒经限制性内切酶双酶切及DNA测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3），经1 mmol/L IPTG 诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE显示出含有完整的ORF的Serpin-6在大肠杆菌BL21（DE3）中不能成功表达，而Serpin-6基因信号肽缺失的片段在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式高效表达。Western-blotting分析表明，被诱导的去信号肽Serpin-6在分子量约为45kDa处检测到一条特异性条带，与预测的融合蛋白分子量大小相符，而对照组BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21和非诱导转化去信号肽目的基因的BL21菌都没有检测到目的条带，进一步证明了去信号肽Serpin-6得到成功表达。但在同样的实验条件下，没有去掉信号肽的Serpin-6基因并没有检测到特异性条带。推测家蚕Serpin-6基因在大肠杆菌中的表达，受其N末端信号肽的影响。