家鸡骨骼肌生长相关长链非编码RNA的鉴定及功能分析

摘要

真核生物的基因组可以转录出大量的非编码 RNA，其中大部分为长链非编码RNA（Long noncoding RNA, lncRNA）。LncRNA不仅数量巨大，而且作用的方式也是多种多样的，其可多层次调控蛋白质编码基因的表达。家鸡不仅是一种重要的遗传学研究模式生物，也是一种重要的经济动物。目前，家鸡lncRNA的研究才刚刚萌芽，骨骼肌生长发育相关的lncRNA还有待发掘。本研究①通过对11胚龄、16胚龄、1日龄的杏花鸡腿部骨骼肌进行RNA-seq，构建差异表达lncRNA与顺、反式靶基因的互作网络（lncRNA-mRNA），鉴定出与骨骼肌生长发育相关的lncRNA；②对7周龄快大型肉鸡（隐性白羽洛克鸡）和慢速型肉鸡（杏花鸡）胸肌组织的差异表达lncRNA（DE-lncRNA）进行顺、反式作用靶基因预测，构建lncRNA与顺、反式靶基因的互作网络（lncRNA-mRNA）；③结合本课题组前期7周龄隐性白羽洛克鸡和杏花鸡胸肌组织的miRNA测序数据，对差异表达的miRNA（DE-miRNA）进行靶lncRNA和靶mRNA预测，构建 lncRNA作为竞争性内源 RNA（ ceRNA）的三者互作网络（lncRNA-miRNA-mRNA），并以lncIRS1招募miR-15家族调控IGF-1信号通路上关键基因IRS1为切入点，探究它们在鸡肌肉生长过程的调控作用。主要结果如下：
　　1、通过对11胚龄、16胚龄、1日龄的杏花鸡腿部骨骼肌进行RNA-seq，鉴定出1995个新的lncRNA。对差异表达lncRNA进行靶基因预测，构建了lncRNA与其靶基因的互作网络（lncRNA-mRNA）。LncRNA-mRNA互作网络的功能与细胞发育，细胞生长和增殖，胚胎发育，机体发育，组织发育，及发育障碍相关。一些肌肉生长相关的lncRNA-靶基因关系对（ lncRNA-mRNA pair），包括 lnc00003323-TEAD4， lnc00005738-DMD，lnc00073545-DLK1，lnc00023378-FGF13，可以作为调控骨骼肌生长的重要候选因子。
　　2、对7周龄隐性白羽洛克鸡和杏花鸡胸肌组织差异表达lncRNA进行了靶基因预测，发现64个DE-lncRNAs靶向67个差异表达基因（DEGs），并构建了lncRNA与其靶基因的互作网络（lncRNA-mRNA）。互作网络的功能与骨骼肌疾病，细胞的组装与组织，及细胞的功能与维持相关。
　　3、成功构建了家鸡骨骼肌生长相关的lncRNA-miRNA-gene互作网络；互作网络中包含1370个 lncRNA-miRNA-gene关系对（lncRNA-miRNA-gene pairs），155个DE-lncRNAs，45个DE-miRNAs，和30个DEGs。MiR-15家族（miR-15a;miR-15b-5p;miR-15c-5p;miR-16-5p;miR-16c-5p）位于互作网络的正中央。以MiR-15家族为中心的lncRNA-miRNA-gene关系对，一共有792对。互作网络中的基因（IRS1，IRS2， FOXO1，FOXO3，FOS）显著富集与IGF-1信号通路。
　　4、通过RACE技术扩增出IRS1和lncIRS1的全长转录本，它们包含了能与miR-15家族结合的序列；双荧光素酶报告基因和RNA结合蛋白免疫共沉淀实验证实miR-15家族同时靶向抑制IRS1和lncIRS1；过表达lncIRS1后，其可吸附更多的miR-15家族，进而促进IRS1的表达；相反，敲低lncIRS1后，其对miR-15家族的吸附能力减弱，进而抑制IRS1的表达。LncIRS1可以通过调控IGF-1信号通路，影响成肌细胞的增殖和分化。
　　综上所述，本研究构建了与家鸡骨骼肌生长相关的lncRNA-mRNA互作网络和lncRNA作为竞争性内源RNA的lncRNA-miRNA-gene互作网络。LncIRS1通过招募miR-15家族调控IRS1表达，影响成肌细胞的增殖和分化。这些以lncRNA为中心的互作网络，进一步完善了家鸡骨骼肌生长的分子调控通路，为促进肌肉生长提供理论基础。

目录

英文缩写词或符号表

第1章 前言

1.1研究背景

1.2 研究意义

1.3 技术路线

第2章 11胚龄、16胚龄和1日龄杏花鸡骨骼肌RNA-seq分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第3章 7周龄家鸡胸肌差异表达lncRNA与靶基因互作网络的构建

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4小结

第4章 lncRNA-miRNA-gene互作网络的构建及通路分析

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4 小结

第5章 LncIRS1通过招募miR-15家族调控IRS1表达影响成肌细胞的增殖和分化

5. 1 引言

5.2材料与方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

第6章 全文讨论与结论

6.1 全文讨论

6.2 论文创新之处

6.3 结论

致谢

参考文献

附录