重组毕赤酵母猪生长激素的可溶性表达及发酵

摘要

猪生长激素（porcine Growth Hormone，pGH）是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞合成190个氨基酸组成的单链多肽类激素激素，具有促进脂肪分解，骨骼生长，提高猪胴体的瘦肉率和胶原合成的功能，能极大改善生猪胴体质量，在生猪养殖业中具有重大的社会经济价值。
　　本研究从猪脑垂体中提取总 RN A，反转录扩增得到猪生长激素的c DN A序列，将其克隆到载体pPICZA、pPICZαA上，构建pPICZA-pGH、pPICZαA-pGH毕赤酵母表达载体，诱导表达后通过SDS-PAGE和Western-blot检测pGH蛋白的表达情况。结果显示：胞内表达pGH蛋白多为不可溶蛋白，而分泌表达pGH蛋白的表达量低，仅有78 mg/L。为了提高pGH表达水平，对猪生长激素pgh基因进行优化，将优化后的基因转化毕赤酵母 X-33，构建胞内表达菌株，结果显示：pGH蛋白在毕赤酵母细胞内仍以不溶蛋白的形式存在，可溶的pGH蛋白很少。为了提高胞内可溶pGH蛋白的含量，构建定位于内质网的pGH表达载体pPIC ZA-pGH（优化）-HDEL与分子伴侣Bip和PDI共表达菌株X33-pGH（优化）-Bip-PDI，SDS-PAGE在共表达菌株胞内沉淀样品中检测到pGH蛋白减少，但是胞内可溶p GH蛋白含量仍然很低，说明分子伴侣Bip和PDI可能导致不溶性pGH蛋白降解，而不能改善pGH蛋白的可溶性。在pGH胞内表达菌株中过表达分子伴侣Ssa1和Sis1，通过SDS-PAGE和Western-blot检测细胞内pGH的表达水平，结果显示：过表达分子伴侣Ssa1和Sis1后，胞内可溶的pGH蛋白水平提高，可溶pGH蛋白为70 mg/L。说明分子伴侣蛋白Ssa1、Sis1可以改善pGH蛋白在毕赤酵母细胞内的可溶性。另外研究了毕赤酵母表达pGH蛋白的条件，在20℃和pH6.0条件下，诱导48小时蛋白表达水平最高，其表达量为340 mg/L。用pGH蛋白刺激猪小肠上皮细胞增殖，MTT法检测在48小时，125μg/L可溶pGH蛋白处理组相比对照组增殖率为249%，125μg/L变性纯化pGH蛋白处理组相比对照组增殖率为211%，说明可溶pGH蛋白和变性纯化pGH蛋白均具有促进猪小肠上皮细胞增殖作用。
　　综上所述，密码子的优化对于pGH蛋白在毕赤酵母中的胞内表达是很有必要的，共表达分子伴侣Ssa1和Sis1，则可以改善pGH蛋白在毕赤酵母细胞内的可溶性，为后续研究毕赤酵母细胞内pGH蛋白的可溶性表达奠定基础。

目录

声明

缩略词及英汉对照

1 前言

1. 1 猪生长激素的研究进展

1. 2毕赤酵母表达系统研究进展

1. 3 本研究的意义和技术路线

2. 1实验材料

2. 2 主要试剂配方

2. 3 试验方法

3. 1 野生型pgh基因在毕赤酵母中的表达

3. 2 野生型pgh基因与优化后pgh基因在毕赤酵母中的表达对比

3. 3 共表达毕赤酵母分子伴侣Bip和PDI

3. 4 共表达毕赤酵母分子伴侣Ssal和Sis1蛋白

3.5 重组毕赤酵母X33-pPICZA-pGH（优化）-Ssa1-Sis1表达

3.6 pGH蛋白的纯化与检测

4. 1 讨论

4. 2 结论

致谢

参考文献