解淀粉芽孢杆菌ZJ6-6产生的抗菌脂肽分析及生防机制研究

摘要

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC）侵染引起的香蕉枯萎病，是香蕉上的一种重要病害，对我国乃至世界香蕉产业造成了极大的危害，其中香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4）以其寄主范围广、致病能力强等特点成为重点防治对象。目前化学防治等方法并不能很好的控制该病害的发生，而环境友好型的生物防治具有巨大的潜能，目前已经有一些芽孢杆菌作为商品菌被成功开发出来。
　　本研究对前人分离得到的一株生防菌——解淀粉芽孢杆菌ZJ6-6进行了进一步的分析研究。通过扫描电镜及透射电镜观察ZJ6-6对Foc4外部形态和细胞内部的变化；利用盆栽试验，研究了其对Foc4的防治效果；使用荧光定量PCR技术检测不同时间点发酵液中脂肽抗生素合成基因的表达量；然后利用液质联用（LC-MS）技术对ZJ6-6发酵液中的脂肽抗生素进行了鉴定，初步探究了菌株ZJ6-6产生的脂肽抗生素类型以及对 Foc4的作用机制，为开发一种新的商品生防菌提供了理论依据。具体研究结果如下：
　　（1）菌株ZJ6-6与Foc4平板对峙培养时，对Foc4有较好的抑制效果，抑菌圈直径为15.3mm，抑菌率达到69.4%。对峙培养5天后，通过扫描电镜以及透射电镜可观察到 Foc4菌丝出现畸形、孢子塌陷等现象，细胞内的各细胞器变化，其中线粒体的数量显著减少。表明ZJ6-6对Foc4的细胞代谢活动产生了一定程度的影响。
　　（2）盆栽实验发现，菌株ZJ6-6可显著降低Foc4侵染巴西蕉时的发病率，其病情指数分别为57.2和85.6，相对防效为33.2%。单独接种ZJ6-6菌液后，其平均株高和鲜重分别为21.7c m、62.5g，对照组平均株高及鲜重为15.8c m、43.6 g，相比对照分别增加37.3%、43.3%，证明ZJ6-6除了能够防治Foc4外，还能促进植株的生长。
　　（3）利用菌液PCR扩增了与脂肽抗生素合成相关的8个基因：ituD、bmyB、fenD、srfAA、srfAB、bioA、yndJ、yngG，且都能扩增到目的条带，然后通过荧光定量 PCR对这些基因在发酵液中不同时间点的表达量进行了检测，结果显示，这些基因的表达量均在16-24h左右显著上升，各基因在不同时间点的表达量都存在显著的差异。
　　（4）经过LC-MS分析，证明菌株ZJ6-6发酵液粗提物中含有脂肽类抗生素surfactin，检测到的质荷比（ m/z）在1008、1022、1036和1050附近，由此推测脂肽粗提物中可能含有C13-15 SurfactinA、C14-16 SurfactinB或C16 SurfactinC。这些Surfactin同系物在菌株发酵1d和2d后含量有一定增加，但变化并不显著，但发酵3d之后，2号峰与5号峰对应的surfactin同系物含量上升较为明显，与发酵一天的相比有显著差异，而峰图3和4对应的脂肽含量有部分减少，但差异并不显著。

目录

声明

缩写词及英汉对照

1 前言

1. 1 香蕉枯萎病的研究概况

1.1.1 香蕉及香蕉枯萎病的发展历程

1.1.2 香蕉枯萎病的发病症状

1.1.3 香蕉枯萎病的致病机理

1.1.4 香蕉枯萎病的防治措施

1. 2 芽孢杆菌生防机制

1.2.1 竞争作用

1.2.2 拮抗作用

1.2.3 溶菌作用

1.2.4 促生及诱导植物抗性

1. 3 脂肽抗生素研究进展

1.3.1 抗菌脂肽的研究历程

1.3.2 脂肽合成相关基因

1.3.3 脂肽抗生素的结构及特征

1.3.4 脂肽抗生素的质量分析

1. 4 本研究的目的和意义

2. 1 实验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3主要试剂及配方

2. 2 实验方法

2.2.3 盆栽防效实验

2.2.4 ZJ6-6脂肽抗生素合成基因的分析

2.2.5 ZJ6-6脂肽抗生素合成基因在不同时间段的表达量

2.2.6 ZJ6-6发酵液中脂肽抗化合物的分析

2.2.7不同浓度surfactin对Foc4生长的影响

3 实验结果

3.1 生防细菌ZJ6-6与Foc4的对峙培养

3. 2 电镜观察

3.2.1 对峙培养菌丝与野生型菌丝扫描电镜比较

3.2.2 对峙培养菌丝与野生型菌丝透射电镜比较

3. 3 盆栽防治实验

3.4 ZJ6-6脂肽抗生素合成基因的分析

3.4.1 菌液PCR扩增ZJ6-6的8个脂肽抗生素合成基因

3.4.2 ZJ6-6 8个脂肽抗生素合成基因的同源性测定

3.4.3 不同时间点8个脂肽抗生素合成基因的相对表达量测定

3.5 菌株ZJ6-6发酵液原液及粗提物的LC-MS分析

3.5.1 菌株ZJ6-6脂肽类物质HPLC分离结果

3.5.2 菌株ZJ6-6发酵液原液与粗提物几个主峰的比较

3.5.3 菌株ZJ6-6脂肽类物质相对分子质量分析

3.5.4 不同浓度surfactin对Foc4生长的影响

3.5.5 不同时间点脂肽粗提物含量的变化

4. 1 结论

4. 2 讨论

4.2.1 菌株ZJ6-6的抑菌作用及应用前景

4.2.2 芽孢杆菌的盆栽防治效果

4.2.3 脂肽类抗生素脂肽抗生素合成基因的分析

4.2.4 脂肽类抗生素的鉴定

4.2.5 不同时间点产脂肽类物质的研究

4. 3 进一步研究建议

致谢

参考文献