印度梨形孢在大花蕙兰快速繁殖中的应用

摘要

大花蕙兰（Cymbidium hybridum）又名虎头兰，属于兰科兰属植物。大花蕙兰主要通过组织培养技术繁殖，在出瓶后的早期生长缓慢，病害发生率高。印度梨形孢（Piriformospora indica）是一种寄主广泛的有益内生真菌,同时也被认为可能是兰科植物的菌根真菌类型。那印度梨形孢与大花蕙兰能否形成菌根结构，并发挥其促进宿主生长、增强其抗病性的作用呢？
　　本文主要进行了两方面的研究：一是通过显微结构和超微结构观察对比分析了印度梨形孢DSM11827与瘤菌根菌M L01和大花蕙兰形成的共生结构，并比较了各菌株的共生效应；二是通过平皿对峙、瓶内共培养方法对比了印度梨形孢与假菌根菌（Scytalidium lignicola）Cy5-1对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）T的拮抗效应。从而探讨印度梨形孢在大花蕙兰种苗生产中的应用潜力。主要的研究结果如下：
　　1.在DE培养基中，印度梨形孢能够与大花蕙兰形成菌根共生结构。 DSM11827菌丝缠绕根毛进入根被并不断延伸形成新的菌丝分枝，在短分枝上形成孢子，菌丝在细胞间隙延伸，在质外体空间生长，缠绕形成菌丝团，符合兰科植物菌根的结构特点。菌丝在各细胞之间延伸繁殖，20 d后开始降解，菌丝与植物体之间达到相对平衡。
　　2.在瓶内共培养环境中，共生培养基中氮源种类显著影响大花蕙兰幼苗生长及各菌株的共生效果。铵态氮比例偏高有利于未菌根化大花蕙兰幼苗鲜重和株高的增加以及根系生长；DSM11827在NO3-/NH4+为4:1的无机氮源条件下和仅添加有机氮源的DE培养基中能显著促进大花蕙兰幼苗鲜重增加；而菌株 ML01仅在无机氮源条件下实现了与兰苗的共生，促进了其鲜重增加和根系生长。
　　3.盆栽条件下，印度梨形孢与大花蕙兰共生促进了生物量的累积和新根发生和生长，提高了大花蕙兰地上部分N、P元素的积累和地下部分Fe的吸收。
　　4.平皿对峙条件下，DSM11827和Cy5-1组合的抑菌率最高（16.52%），DSM11827与尖孢镰刀菌 T形成抑菌圈，但抑菌效果不显著；真菌 Cy5-1分泌物抑制病原菌 T生长，抑制效果明显。瓶内共培养条件下，DSM11827与植物共生后接种病原菌T，病情指数和发病情况有所降低，能够有效地缓解病害症状。
　　5.印度梨形孢与大花蕙兰共生激活了兰苗地上部分SOD、CAT和PPO活性，激活了地下部分PPO活性，提高植物的抗氧化能力；接种尖孢镰刀菌T后，DSM11827处理组地上部分中SOD活性和CAT活性不断上升，POD酶活性和PPO酶活性提前10d达到峰值，在兰苗的地下部分中，处理组和对照组的SOD、POD、CAT和PPO酶活性没有显著差异。在尖孢镰刀菌T侵染条件下，接种DSM11827增强了兰苗地上部分对病原菌的防御能力，对地下部分防御病原菌的效果不显著。
　　6.接种印度梨形孢后大花蕙兰地上部分和地下部分的PAL酶活性不断提高，促进了兰苗体内次生代谢物质的产生；在接种病原菌T后，DSM11827处理组PAL酶活先上升后下降，有效地抑制病原菌在植物体内生长，缓和了基腐病的病情。

目录

声明

1 前言

1. 1 兰科植物菌根的研究现状

1.1.1 兰科菌根真菌

1.1.2 兰科菌根的生理效应

1. 2 蜡壳耳科真菌的研究进展

1. 3 印度梨形孢的研究进展

1.3.1 印度梨形孢的形态特征

1.3.2 印度梨形孢与寄主的互作模式及其对寄主的影响

1.3.3 印度梨形孢与陆生兰的共生效应

1.3.4 印度梨形孢抗病性的研究

1. 4 研究目的与意义

1. 5 主要研究内容

1.5.2 大花蕙兰与印度梨形孢共生培养基的筛选

1.5.3 盆栽条件下接种印度梨形孢对出瓶大花蕙兰幼苗生长和矿质营养吸收的影响

1.5.4 印度梨形孢对尖孢镰刀菌T的拮抗效应及其机理

2 材料与方法

2. 1 材料

2.1.3 培养基

2. 2 方法

2.2.1 植物材料的培养

2.2.2 供试菌株的活化和培养

2.2.3 印度梨形孢与大花蕙兰形成的菌根的显微和超微结构观察

2.2.4 大花蕙兰与印度梨形孢共生培养基的筛选

2.2.5 盆栽条件下印度梨形孢与大花蕙兰的共生效应

2.2.6 印度梨形孢对大花蕙兰抗病性的研究

3 结果与分析

3. 1 印度梨形孢与大花蕙兰形成的菌根的显微和超微结构

3.1.1 不同阶段整体染色结果

3.1.2 不同处理切片观察情况

3.1.3扫描电镜观察结果

3. 2 大花蕙兰与印度梨形孢共生培养基的筛选

3.2.1 不同培养基中大花蕙兰的生长状况

3.2.2 不同培养基中真菌对大花蕙兰的侵染分析

3.2.3 不同培养基中两种真菌对大花蕙兰生物量的影响

3.2.4 不同培养基中真菌对大花蕙兰叶绿素含量的影响

3. 3 盆栽条件下印度梨形孢与大花蕙兰的共生效应

3.3.1 盆栽条件下真菌在大花蕙兰根系中的定殖情况

3.3.2 原接种真菌的检测

3.3.3 大花蕙兰根围真菌的分离和形态特点

3.3.4 根围分离真菌的鉴定

3.3.5 盆栽条件下接种印度梨形孢处理4个月对大花蕙兰生长状态的影响

3.3.6 盆栽条件下接种印度梨形孢4个月对大花蕙兰叶绿素含量的影响

3.3.7盆栽条件下接种印度梨形孢4个月对大花蕙兰矿质元素吸收的影响

3. 4 印度梨形孢对尖孢镰刀菌T的拮抗效应及其机理

3.4.1 益生真菌与尖孢镰刀菌T的平皿对峙结果

3.4.2 接种印度梨形孢对大花蕙兰基腐病发生的抑制效果

3.4.3 不同处理对大花蕙兰超氧化物歧化酶（SOD）的影响

3.4.4 不同处理对大花蕙兰过氧化物酶（POD）的影响

3.4.5 不同处理对大花蕙兰过氧化氢酶（CAT）的影响

3.4.6 不同处理对大花蕙兰多酚氧化酶（PPO）的影响

3.4.7 不同处理对大花蕙兰苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

4 讨论与结论

4. 1 讨论

4.1.1 大花蕙兰根段整体染色方法

4.1.2 印度梨形孢与大花蕙兰形成的菌根结构

4.1.2 印度梨形孢与大花蕙兰共生培养基的筛选

4.1.3 盆栽条件下接种印度梨形孢对大花蕙兰产生的共生效应

4.1.4 印度梨形孢对尖孢镰刀菌T的拮抗效应

4.1.5 印度梨形孢对大花蕙兰尖孢镰刀菌T的拮抗效应机理

4. 2 结论

5 问题和建议

致谢

参考文献

附录