猪细小病毒分离株分析的生物学特性、基因组序列及免疫原性研究

摘要

猪细小病毒病（Porcine Parvovirus Infection，PPI）也称为猪繁殖障碍病，是由猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）引起的一类以初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎等症状为主要特征的疾病，对各种年龄、性别的猪均易感。该病广泛分布于世界各地并呈地方性流行。近年来，猪场PPV的感染率和PPI的发病率都有不断升高的趋势，给养猪业带来了严重的经济损失。因此，了解PPV的病原学特征、遗传特征及免疫原性为PPV的防控提供参考根据，对养猪业的发展具有重要意义。
　　本研究对临床采集的疑似PPV感染病料进行PCR检测，将检测结果呈阳性的病料经处理后接种猪睾丸细胞（Swine testis cell，ST cell）进行病毒分离，得到1株能在ST细胞上稳定繁殖的毒株，命名为PPV GD-2。对该毒株的理化性质进行鉴定后，发现该毒株对氯仿、酸（pH3.0）和胰蛋白酶不敏感，能耐受56℃水浴30 min，与以往报道的PPV特性相符。
　　根据PPV NADL-2序列设计5对引物，对PPV GD-2的全基因组序列进行扩增后测序，得到涵盖全部编码区的长为4322 bp的近全基因组序列。为了探究PPV毒株的遗传进化特征，本研究利用了基于贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛方法（the Bayesian Markov Chain Monte Carlo method）的beast v1.8.3相关软件进行遗传进化分析，进化树分析表明该毒株与经典弱毒株NADL-2的亲缘关系最近，计算得到PPV VP2基因的平均核苷酸替代率为2.3592×10-5个核苷酸/位点/年（95%HPD:1.1051×10-8，5.1334×10-5），PPV毒株的最近共同祖先（The most recent common ancestor，TMRCA）来源于400多年前的1593年。
　　为了了解PPV GD-2感染ST细胞后的增殖情况以及PPV GD-2的培养特性，本研究建立了特异性强、灵敏度高的PPV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，利用建立的方法对PPV GD-2分离株接种ST细胞后不同时期病毒DNA含量进行分析，根据检测结果绘制出了病毒体外增殖的一步生长曲线，在PPV GD-2感染细胞后8 h，病毒开始大量繁殖，呈指数增长，16 h后，随着细胞病变程度加剧，细胞逐渐裂解死亡，病毒DNA含量减少，最后趋于稳定水平。
　　另外，本研究对PPV GD-2的免疫原性进行了分析。利用对PPV敏感的豚鼠建立动物模型，将PPV GD-2免疫豚鼠后，发现其对豚鼠无致病性，且能较好的刺激机体产生持续性的抗体，表明该分离株具有良好的免疫原性。
　　综上所述，本研究从临床疑似感染 PPV的妊娠母猪胎儿体内分离出1株能够在ST细胞稳定增殖的猪细小病毒PPV GD-2，遗传进化分析表明该毒株与PPV NADL-2亲缘关系最近，将该毒株免疫豚鼠后发现其具有良好的免疫原性。

目录

声明

英文缩略词表

1 前言

1.1 猪细小病毒的病原学

1.2 PPV的分子生物学特点

1.3 PPV的检测方法

1.4 PPV的防制

1.5 本论文研究的目的与意义

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 PPV病毒分离鉴定

3.2 PPV基因组序列测定

3.3 PPV基因组的遗传进化分析

3.4 PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的建立

3.5 PPV免疫豚鼠的血清学试验

4 讨论

4.1 病毒分离与鉴定

4.2 全序列测序

4.3 遗传进化分析

4.4 定量PCR

4.5 一步生长曲线

4.6 免疫原性

5 全文总结

致谢

参考文献

附录

附录A PPV GD-2的测序结果

附录B 硕士研究生期间所获科研成果