利用定量蛋白质组学技术研究采后苹果抗冷害机制和植物花色素苷降解规律

摘要

近年来，基于多种植物基因组学的不断完善，蛋白质组学技术在植物生理生化研究中已经成为高效快捷的筛选关键作用蛋白的最重要手段之一。本文利用蛋白质组学技术研究了采后苹果（Malus domestica）果实的抗冷害机制和植物花色素苷降解规律。苹果是典型的呼吸跃变型果实，在冷藏期间最常发生的冷害严重降低了果实的外观品质和食用品质。目前，国内外主要是从生理生化水平和具体预防技术的角度研究苹果冷害，而对深入的抗冷机制研究还不多。本文从贮藏方式、品种差异、砧木类型等不同角度，首次利用蛋白质组学技术比较分析了易冷害与抗冷果实间的蛋白质组差异，从蛋白水平全面分析了苹果果实可能的抗冷机制。
　　包括苹果果实在内的许多果蔬和观赏植物在不同发育期、或遭遇病虫害及环境改变时，出现显著的花色素苷降解现象，影响了这些园艺产品的外观品质。尽管植物花色素苷合成机制得到了广泛研究，但目前花色素苷降解机理仍然不太清楚。本文利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组已全测序的优势，首次利用蛋白质组学技术分析了蓝光处理诱导拟南芥幼苗大量花色素苷合成及其随后花色素苷的迅速降解期间的蛋白质组变化，以筛选出可能参与花色素苷降解的蛋白质；此外，以具有明显褪色现象的鸳鸯茉莉（ Brunfelsia calycina Benth.）花瓣和四季桂（ Osmanthus fragrans var. semperflorens）叶片与基本不褪色而维持红色的月季（ Rosa chinensis Jacq.）花瓣和红背桂（Excoecaria cochinchinensis Lour）叶片为材料，比较分析了它们的花色素苷降解规律，从新的角度探讨了植物花色素苷的降解机制。
　　主要研究结果如下：
　　1.利用定量蛋白质组学技术分析了延迟冷藏预贮处理对采后苹果的抗冷机制
　　软烫伤易感品种?Ambrosia‘苹果采收后于20℃温暖环境下预贮藏7天（延迟冷藏预贮处理）再进行0~1℃冷藏1个月（1 M组）和3个月（3 M组）。与直接冷藏（对照）相比，预贮处理果实冷害发生率明显较低。成功构建了采后直接冷藏和预贮后再冷藏两种贮藏方式下苹果果实蛋白质组差异表达谱。共鉴定到2602个不同蛋白，1 M组和3 M组的三个生物学重复间共同蛋白数量分别是380和425个，其中显著变化蛋白分别为16和36个；整个研究的共同蛋白数量是259个。果实在预贮处理后的抗冷害相关蛋白的表达主要受贮藏方式和贮藏时间的影响。从多个统计学角度分析并首次揭示了 ABC转运蛋白 F家族成员4、O-糖基水解酶、水通道蛋白PIP1-4等膜蛋白可能参与采后苹果果实抗冷害机制；而晚期胚胎发生D-29蛋白、核苷二磷酸激酶、hsp70-Hsp90组织蛋白的表达则与对照果实的冷害发生密切相关。
　　2.比较分析了易冷害与不发生冷害品种苹果果实的蛋白质组差异
　　在品种评估试验（Cultivar Evaluation Trial, CET）中对多个品种苹果果实进行两个季度（CET2014和 CET2015）的采收、冷藏和观察，成功构建了易冷害与抗冷害品种果实之间的蛋白质组差异表达谱。CET2014和 CET2015分别共鉴定到2230和2318个不同蛋白，共同蛋白分别是375和228个，重点显著变化蛋白分别有76和57个。综合两年结果，几乎在所有易冷害品种中都上调表达的重点蛋白有18个，主要有次生代谢物途径相关的咖啡酸 O-甲基转移酶等，信号调节的ras基因相关蛋白Rab7，病程相关的类甜蛋白1a、酸性几丁质酶 SE2，细胞壁降解相关的多聚半乳糖醛酸酶等；都下调表达的有36个，主要有营养储存蛋白（Legumin A）、信号调节蛋白（14-3-3蛋白）、S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶、抑制细胞壁降解相关的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白等。表明这些蛋白可能在诱发或防御多品种苹果果实的贮藏冷害中起关键作用。
　　3.利用定量蛋白质组学技术分析了不同砧木类型?Honeycrisp‘果实的抗冷害机制
　　Geneva砧木?Honeycrisp‘果实采后冷害指数比 Bud.（ Budagovsky）砧木?Honeycrisp‘果实的明显高。因此，本文对冷藏后两种砧木的子类型砧木果实进行了蛋白质组差异表达分析。分别与冷害发生率低的Bud.70-20-20和几乎没有冷害的Bud.9砧木果实相比，Geneva组的三个子类型砧木果实和 Bud.组的两个子类型砧木果实分别共鉴定到不同蛋白977和1098个，其中共同蛋白分别为555和643个，显著差异表达蛋白分别是56和64个。Geneva组显著上调表达的主要蛋白有9个：水通道蛋白PIP2-8、生长素运输蛋白BIG、异丁子香酚合酶1、天冬氨酸蛋白酶、鸟嘌呤脱氨酶等；显著下调表达的主要蛋白有11个：醌氧化还原酶、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶6（PhGPX6）、营养储存相关蛋白、功能未知的2个干燥相关蛋白（desiccation-related PCC13-62）等。Bud.组显著上调表达的主要蛋白有10个：植物PPR蛋白（pentatricopeptide repeat-containing protein）、肉桂酰辅酶 A还原酶1、阳离子过氧化物酶1、抗病相关蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、β-半乳糖苷酶等；显著下调的主要蛋白有24个：种子成熟蛋白、营养储存相关蛋白、70 kDa热休克蛋白等响应胁迫相关蛋白、醌氧化还原酶和 PhGPX6等氧化还原相关的蛋白、碳水化合物代谢相关蛋白（β-葡糖苷酶12）等。表明，冷害指数偏低甚至为0的Bud.砧木果实中存在更多与抗冷害相关的蛋白，而Geneva组可能存在更多与冷害发生相关的蛋白。
　　4.首次分析了拟南芥幼苗花色素苷合成和降解过程中的蛋白质组变化
　　利用蓝光处理（BLT）成功诱导拟南芥幼苗花色素苷大量合成，花色素苷含量（7.76 Abs/g FW）在BLT后的第6天达到最高，是 BLT前的15.2倍，是此时弱白光对照幼苗（CK）的33.7倍，是幼苗转绿后的9.5倍。酚类、芳族酸或苯丙烷类、黄酮醇类等次生代谢物质含量也在 BLT后明显升高并在恢复期间而下降。成功构建了蓝光诱导拟南芥花色素苷合成及其花色素苷降解期间的蛋白质组表达谱。综合花色素苷开始降解到几乎完全降解的显著上调蛋白（即 BLT组相比于 CK组）得到133个重点关注蛋白，在细胞功能和胁迫功能相关方面的显著上调蛋白有：氧化还原相关的蛋白（硫氧还蛋白3、蛋白二硫键异构酶前体、脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶2、谷胱甘肽 S-转移酶6/TAU5等）；转运功能相关的蛋白（网格蛋白重连、外质体包膜蛋白、分泌相关蛋白RAS1B等）；非生物胁迫相关蛋白（阿拉伯半乳聚糖蛋白31、MLP类蛋白等）；信号蛋白（钙结合 EF手的家族蛋白、钙调蛋白1等）；激素相关蛋白（腈水解酶1、脂氧合酶）；蛋白质水解的肽酶类蛋白；次生物质代谢蛋白（2-甲基-6-植酰基-1,4-氢醌甲基转移酶1、脱硫-硫代葡萄糖苷磺酸转移酶18、查耳酮异构酶等）。全文研究的所有显著变化蛋白有517个，其中定位于液泡或者液泡膜的有37个，另外在花色素苷降解期间表达上调的糖苷酶类有阿拉伯半乳聚糖蛋白31、木葡聚糖内切葡聚糖酶/水解酶蛋白7、β-葡糖苷酶23；表达上调的氧化酶类有抗坏血酸过氧化物酶、酰基辅酶 A氧化酶、ACC氧化酶等。表明，蓝光诱导拟南芥幼苗花色素苷合成及其随后的降解期间，大量蛋白表达上调，而与花色素苷降解相关的蛋白可能就隐藏在上述这些重点关注蛋白中。
　　5.比较了不同花色素苷降解模式的观赏植物花瓣或叶片的花色素苷降解规律花色素苷降解降低了园艺产品的观赏性或营养价值。为了研究可能影响花瓣或者叶片在发育成熟期间颜色变化的因素，比较了鸳鸯茉莉和月季花瓣、四季桂和红背桂叶片（即分别代表花色素苷快速降解和缓慢降解的花瓣或叶片类观赏植物）的花色素苷降解。本研究进行了活性胶分析、高效液相色谱分析、细胞中性红和香草醛染色观察、酶动力学测定并进行花色素苷降解相关的过氧化物酶（PODs）的免疫检测等。月季花瓣和红背桂叶片分别比鸳鸯茉莉花瓣和四季桂叶片具有显著较低的花色素苷降解相关的POD活性，可能与其中的高单宁含量相关。表儿茶素没食子酸酯（ ECG）和没食子儿茶素没食子酸酯（ GCG）在月季中分别为161.3±12.34和273.56±41.23μg/g FW，而在鸳鸯茉莉中未检测到；儿茶素-3-没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素（ GC）、没食子酸（ GA）在红背桂叶片中分别为8.33±0.68、3.48±0.04和0.75±0.04 mg/D FW，而表没食子儿茶素（EGC）、ECG在四季桂叶片中分别为4.13±0.21和0.55±0.07 mg/D FW。ECG和GCG抑制鸳鸯茉莉POD的IC50分别为21.5和29.7μM，并且添加到花色素苷溶液中使色素起了增色作用；CG、ECG、GA、GC和 EGC抑制四季桂 POD的IC50分别为14.85、9.27、16.72、36.12和28.1μM。儿茶素和表儿茶素不影响 POD活性，同时用作 POD底物的Km值为0.48和1.23 mM。在四种植物中都检测到与花色素苷降解相关的POD表达量高。综上，高含量的单宁，特别是没食子酸酯类儿茶素，在月季花瓣或者红背桂叶片中可能抑制了与降解相关的酶，导致体内花色素苷的维持和颜色稳定。

目录

声明

英文缩略词及英汉对照表

第1章前言

1.1蛋白质组学与植物生理活动研究

1.2苹果采后贮藏期间生理紊乱病害的抗病研究进展

1.3观赏植物花色素苷降解研究进展

1.4本文的研究内容、目的和意义

第2章采后延迟冷藏与直接冷藏的?Ambrosia‘苹果在贮藏后的蛋白质组差异分析

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5本章小结

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5本章小结

第 4 章 利用定量蛋白质组学技术研究不同砧木类型 ?Honeycrisp‘果实贮藏抗冷害

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果与分析

4.4讨论

4.5本章小结

第5章 蓝光诱导拟南芥幼苗花色素苷合成及其降解期间的蛋白质组学研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5本章小结

6.1引言

6.2材料与方法

6.3结果与分析

6.4讨论

6.5本章小结

7.1本论文创新之处

7.2本论文的展望

致谢

参考文献

在读期间发表论文及奖励