SND菌分离鉴定和nirS基因工程菌YP1S构建及其脱氮效能研究

摘要

污水脱氮一直以来都是人们倍加关注的问题。最近几年发现了一类与传统自养硝化反硝化菌功能不同的脱氮菌种，同时具备着异养硝化和好氧硝化反硝化功能，可实现同步硝化反硝化（Simultaneous Nitrificationand Denitrificaion，SND）脱氮，此类菌的发现与研究对污水脱氮处理具重要应用意义和经济价值。本研究以构建一株高效稳定的脱氮SND工程菌为最终目标，系统地开展了SND菌的筛选鉴定、工程菌构建及鉴定以及脱氮效能特性的研究。
　　首先，利用合适条件对从猪场废水中采集的菌液进行驯化富集和分离纯化后，可获得同步硝化反硝化的菌株，实验筛选得到了六种SND菌株，分别为：YP1、YP2、YP3、YP4、YP5和YP6。六种菌株对NH4+-N和COD均达到90%以上的去除率，其中，YP1和YP4菌株的效能较佳，对NH4+-N去除率高达到94%，说明这六种菌株均有较好的异养硝化作用。六种菌株主要差异表现对TN的去除率方面，六种菌株对TN的去除率分别为（67.98±0.53）%、（39.07±0.96）%、（52.30±0.48）%、（56.92±0.58）%、（44.92±0.63）%和（52.91±0.59）%，其中YP1和YP4最高。同时，YP4菌株也有着最大的NO2--N的积累量为28.98 mg/L，其次是YP1，NO2--N的积累量也达到了25.12 mg/L。运用菌株的生理生化分析和16S rRNA同源比对等方法，对YP1和YP4进行了鉴定，确定YP1为不动杆菌属（Acinetobacter）、YP4为克雷伯什菌属（Klebsiella）。
　　亚硝酸盐还原酶（Nitrite Reductases，NirS）是催化同步硝化反硝化脱氮工艺中最关键的限速步骤，从而加速脱氮进程，为了更好提高菌株脱氮效能，我们通过转基因技术改造反硝化效果较弱的SND菌YP1，利用pUC18-mini-Tn7T-Gm-LacZ20载体质粒和pTNS2辅助质粒，将亚硝酸盐还原酶基因NirS克隆和表达于YP1菌株的核基因组中，成功地构建了一株高效脱氮NirS工程菌株YP1S。根据生物信息学分析，NirS酶是一种分子质量约为98.48 kDa的稳定型蛋白质。经过酶活性和SDS-PAGE蛋白表达检测，工程菌YP1S相对于野生型菌株YP1，表现了出NirS酶的高效表达，且NirS活性高达（301±18.63）U/（mg·L-1），并能促进菌株对NO2--N的降解，降低其在水体中的积累量。将工程菌YP1S与野生型菌株YP1进行对比，YP1S和YP1分别投放到实际污水中处理36 h，YP1S将实际污水中的COD和NH4+-N彻底去除，同时对TN的清除率达到89.23%，比原始YP1菌株对 TN去除率提升了高达25%，YP1S使NO2--N含量由25.12 mg/L下降至3.1 mg/L。
　　研究进一步对工程菌YP1S的脱氮条件进行了探究和优化。通过正交实验结果发现各因素对YP1S的SND脱氮性能的主次影响顺序为：温度＞pH＞C/N＞转速。和响应面进行分析，工程菌YP1S最佳优化条件为：C/N=10、T=30℃、pH=7和r=200 rpm。与市场上商业化硝化菌株B（降亚硝宝）相比，工程菌YP1S对养殖场实际污水的TN和NH4+-N的清除率要高27.57%。同时采用提取所传的每代工程菌YP1S的基因组DNA进行亚硝酸盐还原酶基因NirS的PCR扩增，并经过10代的培养，检测工程菌YP1S的脱氮效能，结果表明，其脱氮效能无巨幅波动，保持转基因改造后的对TN、NH4+-N、NO3--N和COD较高降解效率，稳定性较好，说明NirS基因的扩增无外源基因丢失的现象。
　　综上所述，本文所构建工程菌YP1S具有亚硝酸盐还原酶基因NirS遗传稳定性和脱氮高效稳定性，符合生物脱氮对水质氮素水平的有关要求，而且，在将来的实际试验中会继续观察，深入探讨，以适应和达到大规模投入污水脱氮治理的要求，可用于治理水体富营养化等水污染问题，是一株具有良好应用前景的高效脱氮菌株。

目录

声明

英文缩略语及英汉对照表

1 前言

1.1 污水脱氮技术

1.2 SND菌污水生物脱氮

1.3 SND菌脱氮工程菌的研究

1.4 本论文研究目的与意义

1.5 本论文的研究技术路线

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 主要试剂配方

2.4实验方法

3结果与分析

3.1 SND菌的初步筛选

3.2 初筛6株SND菌的脱氮效能探讨

3.3 SND菌YP1和YP4的鉴定

3.4 亚硝酸盐还原酶基因（NirS）工程菌YP1S的构建

3.5 NirS工程菌YP1S脱氮的影响因子探讨

3.6 响应面正交优化工程菌YP1S实验脱氮条件

3.7 优化条件下工程菌YP1S与商业菌对实际污水的脱氮效能对比

3.8 工程菌YP1S对实际污水脱氮效能的稳定性检测

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间已发表或拟发表的研究论文

附录