脱氮基因工程菌PNS的构建及其应用研究

摘要

目的：采用基因克隆技术构建脱氮基因工程菌PNS，使其高效表达cd1-亚硝酸盐还原酶，催化同步硝化反硝化脱氮工艺中最关键的限速步骤，从而加速脱氮进程，提高脱氮效率，降低脱氮成本。 方法：本研究所采用的实验方法如下： 1．根据GenBank公布的nirS碱基序列和表达载体pQE-30的多克隆位点设计引物，以铜绿假单胞菌PAO1的基因组DNA为模板，应用PCR技术扩增目的片段nirS；之后经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切，定向克隆到pQE-30上，化学转化 DH5α，构建含有重组质粒的转化子pQE30-nirS-DH5α； 2．经酶切和测序鉴定后，将重组质粒pQE30-nirS转化表达菌株SG13009，构建脱氮基因工程菌PNS，再用SDS-PAGE和His-tag in-gelStain鉴定PNS所表达的外源性蛋白(cd1-NIR)的分子量和特异性； 3．为了使PNS能够在实际的污水环境中发挥高效的脱氮功能，又对其在厌氧和20℃低温环境中的表达情况进行了科学和详实的分析，同时也对诱导剂IPTG的最佳诱导浓度和最适诱导时间进行了合理的优化。 结果：本研究通过上述实验所取得的主要结果如下： 1．应用PCR技术成功扩增了编码cd1-NIR的nirS基因；经过双酶切和定向克隆，成功构建重组表达质粒 pQE30-nirS；经过测序和BLAST显示，表达质粒pQE-30中的插入序列与GenBank公布的基因序列完全一致。 2．将重组表达质粒pQE30-nirS转化表达菌株SG13009，经SDS-PAGE的分子量鉴定和His-tag in-gel Stain的特异性鉴定，成功构建了脱氮基因工程茵 PNS。 3．在厌氧和低温的环境中，重组蛋白 cd1-NIR 均获得了较高水平的表达；同时通过蛋白质表达形式的分析显示，在厌氧和低温的环境中，PNS所表达的可溶性 cd1-亚硝酸盐还原酶的百分比均大于其最适的生长环境。 结论：成功构建了高效表达cd1-亚硝酸盐还原酶的基因工程菌PNS，并对其在污水生境中的表达情况进行了科学的分析，为其进入实际应用提供了重要的参数。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分nirS基因的克隆与重组质粒pQE30-nirS的构建

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分脱氮基因工程菌PNS的构建及cd1-NIR的表达与鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分PNS在实际应用中的参数研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

全文总结

参考文献

文献综述：微生物在城市污水处理系统中的应用与展望

致谢

攻读学位期间发表的文章及参加的学术会议