重组人源抗HBsAg单链抗体-干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究

摘要

目前乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有3.5亿患者受其困扰.随着抗HBsAg单克隆抗体和抗体片段的研究开发,发现能够和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞的活性,而融合了对病毒有较好临床治疗效果的干扰素γ的双功能抗体将能够起到导向性预防和治疗的双重作用.该文在前期工作的基础上,将抗HBsAg单链抗体(single-chain Fv against HBsAg,HBscFv)基因与干扰素γ(IFNγ)基因在体外拼接成单一基因,然后转入巴氏毕赤酵母中分泌表达,并对表达产物进行了纯化及体外生物学活性和理化性质鉴定.通过上述实验,获得了人源抗HBsAg的HBscFv-IFNγ单链基因,并首次在巴氏毕赤酵母中获得高效分泌表达HBscFv-IFN,这为进一步研究该HBscFv-IFNγ融合蛋白的导向性机制以及治疗、预防HBV相关疾病的临床前、三期临床和临床应用开发打下了良好基础.

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第一章绪论

1.1重组抗体的种类

1.2双功能抗体的类型

1.2.1双功能抗体

1.2.2酶标抗体

1.3干扰素γ的生物活性及其与肝炎的临床治疗

1.4 E.coli表达系统

1.5昆虫表达系统

1.5.1杆状病毒表达系统

1.5.2稳定表达系统

1.6哺乳动物细胞表达系统

1.7毕赤酵母表达系统

1.7.1甲醇代谢途径和甲醇代谢表型

1.7.2表达载体构成元件

1.7.3宿主菌

1.7.4遗传操作特性

1.7.5表达质粒与酵母基因组整合

1.7.6构建多拷贝整合菌株

1.7.7高密度发酵

1.7.8分泌蛋白的糖基化

1.7.9蛋白表达量

1.8抗体表达系统的选择

1.9抗HBsAg基因工程抗体及双功能抗体的研究现状

1.10本课题的研究背景、意义和主要内容

1.10.1研究背景和意义

1.10.2主要内容

第二章体外人源抗HBsAg单链抗体-干扰素γ基因及其多拷贝载体的构建

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1菌株和质粒

2.2.2引物

2.2.3主要试剂

2.2.4主要仪器和设备

2.3实验方法

2.3.1质粒的小量提取

2.3.2 PCR反应

2.3.3 DNA片段胶回收

2.3.4 HBscFv-IFNγ片段克隆至pPICZaA

2.3.5 DNA序列测定

2.4结果与讨论

2.4.1体外构建单链抗体-干扰素γ基因

2.4.2构建重组质粒pPICZaA/HBscFv-INFγ

2.4.3 HBscFv-IFNγ序列测定结果

2.5 pPICZaA/HBScFv-IFNγ体外多拷贝的构建

2.5.1体外构建pPICZaA/HBScFv-IFNγ多拷贝的设计方案

2.5.2 pPICZaA/(HBscFv-IFNγ)2的构建

2.5.3 pPICZaA/(HBscFv-IFNγ)4，pPICZaA/(HBscFv-IFNγ)6等多拷贝载体的构建

2.6本章小结

第三章人源抗HBsAg单链抗体-干扰素γ融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1菌株和质粒

3.2.2主要试剂

3.2.3主要仪器和设备

3.3实验方法

3.3.1质粒DNA的大量制备

3.3.2重组质粒的线性化

3.3.3制备酵母感受态细胞

3.3.4重组质粒转化酵母细胞

3.3.5菌落PCR检测目的基因整合

3.3.6多拷贝转化子的筛选

3.3.7转化菌株Mut类型的确定

3.3.8转化菌株的诱导表达

3.3.9蛋白质的浓缩

3.3.10制备鼠抗HBscFv单克隆抗体

3.3.11 Western-blot分析

3.3.12间接ELISA

3.3.13竞争ELISA

3.3.14酵母表达HBscFv-INFγ的初步提取纯化

3.4结果与讨论

3.4.1 LiCl法转化毕赤酵母GS115。

3.4.2、电转化法转化酵母X33

3.4.3、酵母基因组DNA的提取与PCR检测

3.4.4 HBscFv-IFNγ基因在重组酵母中的诱导表达

3.4.5 Western-blot分析酵母表达上清中的HBscFv-IFNγ

3.4.6酵母菌体蛋白SDS-PAGE分析结果

3.4.7多拷贝转化子筛选结果

3.5讨论

3.6本章小结

第四章重组人源抗HBsAg HBscFv-IFNγ的纯化和理化性质的研究

4.1引言

4.2实验仪器、材料

4.2.1菌株

4.2.2主要试剂

4.2.3主要仪器设备

4.3实验方法

4.3.1 Con-Sepharose 4B亲和层析纯化重组HBScFv-IFNγ

4.3.2 14F7亲和层析纯化重组HBscFv-IFNγ融合蛋白

4.3.3PAS糖蛋白染色

4.3.4 Bradford法测定蛋白含量

4.3.5 ELISA测定重组HBScFv-IFNγ融合蛋白抗体抗原结合活性

4.4结果与分析

4.4.1 HBscFv-IFNγ融合蛋白理化性质的预测结果

4.4.2转化菌株表达上清的浓缩

4.4.3凝胶过滤脱盐

4.4.4 Con-Sepharose 4B亲和层析纯化HBscFv-IFNγ

4.4.5 14F7亲和层析纯化HBscFv-IFNγ

4.4.6糖蛋白分析

4.4.7 ELISA结果

4.5讨论

4.6本章小节

第五章工程酵母表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化

5.1引言

5.2实验仪器和材料

5.2.1菌株

5.2.2主要试剂

5.2.3培养基和溶液

5.2.4主要仪器设备

5.3实验方法

5.3.1培养时间对HBscFv-IFNγ表达的影响

5.3.2摇瓶装液量对HBscFv-IFNγ表达的影响

5.3.3不同接种量对HBscFv-IFNγ表达的影响

5.3.4不同甲醇添加量对HBscFv-IFNγ表达的影响

5.3.5发酵液甲醇浓度的测定

5.4结果与分析

5.4.1重组HBscFv-IFNγ工程酵母的生长曲线和产物积累曲线

5.4.2摇瓶装液量对表达HBscFv-IFNγ影响的结果

5.4.3不同接种量对表达HBscFv-IFNγ影响的结果

5.4.4甲醇浓度对表达HBscFv-IFNγ影响的结果

5.4.5培养参数的优化

5.5本章小结

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢