金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）固态发酵的优化研究

摘要

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种广谱虫生真菌,在生物防治中有重要的应用价值.固态发酵具有设备投资少、能耗低、污染少容易操作等特点,非常适用于金龟子绿僵菌的大规模培养和生产.该论文对筛选出来的高产孢金龟子绿僵菌M.2,进行菌体萌发产孢的观察,优化了麸皮—玉米粉琼脂高孢平板培养基和甘蔗渣培养基,并用自行设计的固态发酵反应器进行固态发酵扩大培养控制参数的研究,取得了较满意的结果.1.对广州市微生物研究所提供的混合金龟子绿僵菌进行筛选,筛选出M.2高产孢菌,培养皿培养的产孢量达7.53×10<'10>个孢子/平板,在麸皮培养基上为2.87×10<'9>个孢子/g干培养基.2.对筛选出的M.2进行了固态发酵过程中二氧化碳、氨基葡糖、菌体量和底物干重减重的测定.通过检测固态发酵物中氨基葡糖含量推算菌体量,另外,通过底物干重减重方法可以定性评估生物体生长状况.3.优化麸皮—玉米粉琼脂平板培养基,得到高产孢的培养基配方:基料为麸皮50g/L、玉米粉10g/L;无机离子的最优水平为KH<,2>PO<,4>2g/L、MgSO<,4>1.5g/L、CuSO<,4>15mg/L.收集的孢子粉测得其含水量为11.37﹪,孢子粉含孢量为1.6×10<'13>个孢子/g孢子粉,孢子粉的萌发率为97.6﹪.4.选取甘蔗渣为固态培养基基料,经过单因次和正交试验得到优化配方:70﹪甘蔗渣,30﹪玉米粉,初始加水量40﹪,KH<,2>PO<,4>0.1﹪、MgSO<,4>0.5﹪、CuSO<,4>150ppm.用优化的甘蔗渣培养基培养金龟子绿僵菌,产孢量达到5.1×10<'10>个孢子/g干培养基.5.根据固态发酵反应器设计原理,设计总体积为10.7L的生物反应器,底部为无菌蓄水池,填料层为7.6L,采用正向通风,空气先经过底部水浴区后,接近为饱和的湿空气,再进入料层保证发酵前期高湿,后期低湿.6.利用麸皮固态培养基进行金龟子绿僵菌固态发酵扩大培养,并对过程参数进行研究.最终确定过程控制参数为通入空气控温20℃,初始含水量为55﹪,采用变通风量,0~12小时不通风、12~24小时通风率为3.28vvm、24~60小时通风率为3.93vvm、60~96小时通风率为3.28vvm、96~120小时通风率为2.62vvm,每12小时搅拌一次,发酵96小时收集孢子.在最优条件下,金龟子绿僵菌固态发酵最终的产孢量为1.08×10<'11>个孢子/克干培养基.

目录

文摘

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第一章绪论

1.1绿僵菌的研究概况

1.1.1金龟子绿僵菌的形态

1.1.2绿僵菌的分类

1.1.3金龟子绿僵菌对昆虫的侵染机理

1.1.4绿僵菌的发酵培养与生产

1.2固态发酵新技术与反应器的研究进展

1.2.1固态发酵工艺条件的控制

1.2.2国内外固态通风发酵反应器现状及研究进展

1.3剂型的研究进展

1.3.1绿僵菌制剂的贮存

1.3.2绿僵菌制剂剂型的确定

1.4应用领域

1.4.1防治农业害虫

1.4.2防治森林害虫

1.4.3防治经济作物害虫

1.4.4防治卫生害虫

1.5本论文研究的意义和主要内容

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3主要试剂

2.2主要仪器及设备

2.3实验方法

2.3.1菌体的分离纯化

2.3.2金龟子绿僵菌培养方法和条件

2.3.3分析方法

第三章菌种分离筛选及生物量的测定

3.1菌体的分离纯化

3.2菌落形态观察

3.3菌种保藏

3.4不同菌株的产孢研究

3.4.1 PDA平板培养的菌株产孢量比较

3.4.2麸皮培养基固态发酵产孢量比较

3.5固态发酵过程中培养基表观及菌体形态变化研究

3.5.1培养基表观

3.5.2金龟子绿僵菌M.2分生孢子的萌发过程

3.6生物量的测定

3.6.1产孢量的测定

3.6.2 CO2生成量的测定

3.6.3氨基葡糖的测定

3.6.4底物干重减重的测定

3.6.5底物干重减重与菌体量的关系

3.7本章小结

第四章金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)培养基的优化研究

4.1培养基和培养条件

4.1.1培养基组成

4.1.2培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性

4.1.3培养基的成分

4.2金龟子绿僵菌培养条件的控制

4.3产高孢平板培养基的优化

4.3.1不同接种量对高孢平板产孢的影响

4.3.2金龟子绿僵菌产高孢平板培养基的优化

4.3.3金龟子绿僵菌孢子粉的制备

4.4甘蔗渣固态培养基的优化

4.4.1单因素影响

4.4.2甘蔗渣固态培养基优化正交试验

4.5本章小结

第五章 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)固态发酵反应器的设计

5.1固态发酵反应器的设计原理

5.2试验用反应器的设计与研制

5.2.1固态发酵生物反应器结构图

5.2.2反应器的整套装备图

5.3反应器设计的特点

5.4本章小结

第六章金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)固态发酵反应器控制参数的优化研究

6.1金龟子绿僵菌固态发酵温度控制的优化

6.1.1通入空气控温对金龟子绿僵菌固态发酵温度的影响

6.2搅拌对金龟子绿僵菌固态发酵的影响

6.2.1搅拌对金龟子绿僵菌固态发酵散热的影响

6.2.2搅拌对金龟子绿僵菌固态发酵产孢的影响

6.3培养基初始含水量对金龟子绿僵菌固态发酵的影响

6.3.1培养基初始含水量对金龟子绿僵菌孢子萌发的影响

6.3.2培养基初始含水量对金龟子绿僵菌产孢量的影响

6.4通风量对金龟子绿僵菌固态发酵的影响

6.4.1不同通风量对金龟子绿僵菌固态发酵的影响

6.4.2通风量的分阶段控制对金龟子绿僵菌固态发酵的影响

6.4.3最佳变通风量条件下物料层参数的变化

6.5发酵终点时间的确定

6.6本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢