SARS-CoV M蛋白编码基因的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

摘要

SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染引起严重急性呼吸综合症(SARS)。2003年冬春之际，SARS在我国以及世界上多个国家和地区爆发流行，对人类健康、经济发展和社会稳定造成了严重的危害。世界卫生组织曾发出警告：SARS是进入21世纪，严重威胁人类健康的疾病，是继艾滋病后，第二个能引起全球流行的新发传染病，这受到全世界广泛的关注，世界各国专业人士认为研制SARS疫苗是预防和控制SARS的关键。 SARS-CoV是一种单股正链RNA病毒，长约29,727个核苷酸，在rep基因下游有四个主要的开放阅读框，编码S、E、M和N这四个所有冠状病毒都具有的结构蛋白。M蛋白是SARS-CoV的一种重要的结构蛋白，在己知的冠状病毒的结构蛋白中它的含量是最丰富的，最主要的是它能引起宿主产生中和抗体。另外，M蛋白和病毒的出芽和装配有关。M蛋白含有高度保守的糖基化序列，而且它的糖基化可能与病毒和宿主的相互作用有关。由于M蛋白在冠状病毒的生命周期中具有重要作用，而且它有免疫原性，这使它成为抗SARS药物研究、疫苗研发和血清学诊断方法的确立过程中非常有吸引力的靶标。该项研究利用基因重组技术，将SARS-CoVM蛋白编码基因通过裂殖酵母附加型载体在裂殖酵母TCP1中表达，构建了胞内表达SARS-CoVM蛋白的基因工程菌。 首先设计特异性的引物利用RT-PCR技术，以SARS-CoV总RNA为模板体外扩增出SARS-CoVM蛋白编码基因。然后就将扩增得到的目的片段连接pMD18-T载体进行测序。将测序结果进行序列分析，与GeneBank中的SARS-CoVM序列进行比较，发现此编码基因的序列与SARS-CoV很多菌株的M基因几乎是100％同源。设计带有Kozak序列的引物对验证测序正确的pMD18-T-M进行扩增得到目的基因，选择带有标记的表达载体，将目的基因TOPO克隆进表达载体的克隆位点，使其融合于载体中的V5多肽和6×His多肽的上游，可利用它们进行产物的分离、纯化和检测。经过PCR鉴定后，构建得到重组酵母表达载体。将重组表达载体pNMT1-M用电转化法转化裂殖酵母TCP1，重组载体含有ars1，因而能在酵母中自主复制。在含有硫胺素的亮氨酸营养缺陷型平板EMM上筛选重组转化子，通过菌落PCR法进行初步鉴定。然后将初步筛选出来的重组子提取酵母质粒并通过PCR的方法进行鉴定。最终筛选得到含有重组质粒pNMT1-M的酵母转化子。 对重组酵母进行特性研究，发现重组酵母的质粒稳定性很高；根据宿主菌和重组菌在不同生长时期培养液中的细胞密度(OD值)绘制它们的生长曲线图，分析两者生长规律，结果表明两者并无太大差别。说明外源基因的导入对宿主酵母的生长无明显干扰。将重组菌液体摇瓶培养并去硫胺诱导表达外源蛋白，经诱导16h左右后离心收集菌体，玻珠法破壁提取蛋白后进行SDS-PAGE分析，再通过Westernblot进一步鉴定，结果确定了重组菌培养液能够表达SARS-CoVM蛋白。 该项研究建立的裂殖酵母表达系统能够有效的表达下游标记V5和6×His多肽的重组SARS-CoVM蛋白，为SARS疫苗研究提供了实验基础。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1 SARS-CoV简介

1.1.1 SARS-CoV的病毒学分类

1.1.2 SARS-CoV的形态特征和相关冠状病毒受体

1.1.3 SARS-CoV基因组学特点

1.1.4 SARS-CoV蛋白组学特点

1.1.5 SARS-CoV M蛋白简介

1.2 SARS疫苗研制背景及可能性

1.2.1 SARS疫苗研究的背景和必要性

1.2.2核酸疫苗

1.2.3抗原表位亚单位疫苗

1.3常用酵母表达宿主及载体

1.3.1酿酒酵母及载体

1.3.2甲醇营养型酵母及载体

1.3.3克鲁维亚酵母及表达载体

1.3.4解脂耶氏酵母及其表达载体

1.3.5裂殖酵母及其载体

1.3.6酵母表达系统的优缺点

1.4 SARS-CoV M蛋白编码基因表达研究进展

1.5本课题的研究意义主要内容

1.5.1本课题研究意义

1.5.2本课题研究内容

第二章实验材料与方法

2.1实验材料与设备

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要试剂

2.1.3质粒和菌株

2.1.4培养基和常用溶液配制

2.2实验流程与方法

2.2.1实验流程

2.2.2目的基因片段的获得

2.2.3核酸的回收、纯化与浓缩

2.2.4目的基因的测序

2.2.5重组表达载体构建及鉴定

2.2.6裂殖酵母S.pombe的转化

2.2.7酵母基因工程菌的诱导表达

2.2.8表达产物分析

第三章结果与讨论

3.1表达宿主菌和表达载体的选择

3.1.1宿主菌的选择

3.1.2表达载体的选择

3.2 SARS-CoV M蛋白编码基因的克隆

3.2.1 PCR引物设计

3.2.2 SARS-CoV M蛋白编码基因的获得

3.3目的基因片段连接T载体并测序

3.3.1连接T载体及转化子鉴定

3.3.2目的基因片段测序和结果分析

3.4重组表达载体的构建与鉴定

3.4.1目的片段的获得

3.4.2 pNMT1载体与M基因的连接和转化

3.4.3筛选与鉴定

3.5裂殖酵母TCP1的转化

3.5.1重组质粒pNMT1-M在裂殖酵母TCP1中的转化

3.5.2重组转化子的鉴定

3.6重组酵母中质粒稳定性的研究

3.7重组酵母菌生长曲线的测定

3.8重组SARS-CoV M蛋白在裂殖酵母中表达及其鉴定

3.8.1 SARS-CoV M蛋白在裂殖酵母中的表达

3.8.2表达产物的Western-blotting分析

结论与展望

参考文献

发表与学位论文内容相关的学术论文

致谢