超声场影响大肠杆菌细胞膜通透性的研究

摘要

超声新技术的出现引起了人们的浓厚兴趣，已广泛应用于生物和医学领域，特别在对细胞膜的影响方面成为研究热点。提高膜通透性在获取胞内产物或使胞外大分子进入胞内方面有重要的应用意义。传统用于提高细胞膜通透性的是化学法具有处理时间长、效率低、试剂用量大、成本高、后处理麻烦等缺点。本论文以基因工程上常用的大肠杆菌为研究对象，研究了不同超声参数对细菌细胞膜通透性的影响。在此基础上，对超声作用参数进行优化，选择合理的超声条件，确定超声提高大肠杆菌细胞膜通透性的最适工艺条件。进而与化学方法进行比较。研究中应用荧光探针法考察细胞膜通透性、膜电压，胞内活性氧(ROS)、游离钙(Ca2+)的变化并且利用扫描电镜、透射电镜观察，从微观角度分析超声场提高大肠杆菌细胞膜通透性的机理。建立超声作用大肠杆菌细胞膜变化的动力学模型。研究表明： 变幅杆浸入式超声的功率、作用时间、间隙时间(频率为25kHz)对大肠杆菌膜的通透性及生存率均有影响。对这三个参数进行三因素三水平正交实验，其结果显示，超声的电功率、作用时间对大肠杆菌生存率的影响极显著，间隙时间对大肠杆生存率的影响不显著；超声波的电功率、作用时间对大肠杆菌的细胞膜通透性影响极显著，间隙时间对大肠杆菌细胞膜通透性的影响显著。影响大肠杆菌细胞膜通透性大小先后次序为：作用时间＞电功率＞间隙时间。优化提高大肠杆菌细胞膜通透性的最佳作用参数为：作用电功率为300W、作用时间为90s、间隙时间为4s。 化学方法与超声方法比较。实验表明：化学方法可以提高细胞膜的通透性，但是对细胞活性的影响很大，经过处理后的大肠杆菌的存活率很低。该方法提高细胞膜通透性时用的化学试剂消耗量大、费用高，试剂残留造成环境污染，而且后处理过程复杂，不易实现生产连续化。适当超声处理不仅可以提高细胞膜对代谢产物的通透性，使细胞仍保持一定的活性，而且操作参数易控制、目标产物易分离、无残余毒性、与环境友好、高效、价廉、无污染、适用性强、易于实现自动化、连续化、具有极大的应用潜力，显示出超声方法的优越性。 利用荧光探针FDA检测来反映细胞膜通透性的变化。FDA负载入大肠杆菌后发出黄绿色荧光，说明利用FDA荧光探针染色法标记可行。结果显示：在25kHz、300W、90s内，荧光强度渐渐降低，90s时下降到66.7﹪，即细胞膜通透性增加33.3﹪，此时细胞生存率为79.4﹪，再随作用时间延长，FDA明显下降，是由于细胞生存率明显下降引起。 利用荧光探针DiBAC4(3)检测来反映细胞膜电压的变化。DiBAC4(3)载入大肠杆菌后发出亮绿荧光，利用DiBAC4(3)荧光探针染色法标记可行。结果显示：在25kHz、300W、30s-90s内荧光强度逐渐下降，90s时降为73.2﹪，即膜电压下降26.8﹪，随着时间的延长DiBAC4(3)明显降低。在90s时细胞的存活率为79.4﹪。超声作用90s内后膜电压下降，胞内外离子浓度差加大，促进了分子交换速度。超声波场引起的细胞膜电压比较大，使得Ca2+内流量较大时，K+大量外流占优势，结果导致细胞膜电压进一步超极化，膜电压探针荧光下降。导致膜电压依赖的Ca2+、Na+以及大分子物质离子通道都打开，膜两侧离子交流加速，即膜的通透性增加。 利用荧光探针DCFH-DA法检测来反映胞内活性氧的变化。大肠杆菌经DCFH-DA负载发出绿色荧光，DCFH-DA荧光探针染色法标记可行。结果显示：经25kHz、300W，30-90S超声作用后DCFH-DA增加，说明一定超声作用后大肠杆菌细胞内活性氧水平提高。在超声作用的空化效应特别易产生活性氧(包括自由基)，使脂双分子层过氧化而有破坏膜结构。膜变脆易穿孔，流动性也变差。ROS水平上升导致ROS依赖性的钙离子通道打开，进而钙离子依赖性的其它(K+，Na+等)通道也打开，膜两侧物质交流加速，即膜通透性增加。 利用荧光探针Fura-2/AM法检测来反映胞内钙离子的变化。大肠杆菌经Fura-2/AM负载后发出亮蓝色荧光，Fura-2/AM荧光探针染色法标记可行。结果显示：经25kHz、300W，30-60S超声作用后Fura-2/AM荧光强度增加，说明一定超声作用后大肠杆菌经胞内钙离子水平提高。ROS水平增加，在信号传导中可导致钙高子通道打开，离子内流，胞内钙浓度增加，实验证实胞内钙离子浓度是增加了，即膜通透性增加。 扫描电镜、透射电镜观察显示：未经超声处理的细胞结构完整，细胞核、表面光滑，细胞膜清晰，膜没有变化，没有损伤。经25kHz、300W、30s超声处理后细胞形态特征表现为细胞结构完整，细胞膜形态开始改变，细胞内部结构完整。经25kHz、300W、60s超声处理后细胞膜完整脂双分子层开始变模糊，经25kHz、300W、90s显示表面有小孔的地方，内容物向外渗透。经300W、150s细胞膜受严重，细胞质外渗，细胞开始自溶。经25kHz、300W、270s显示随超声处理时间的延长细胞核破裂，细胞膜破坏，细胞变成碎片。在一定超声作用下大肠杆菌膜通透性改变和膜穿孔。超声空化产生自由基使膜脂过氧化，因而对细胞膜产生破坏作用，使膜结构破坏、崩解而影响其通透性。超声作后细胞膜的电特性(电压、电导和膜电容等)、机械特性(膜的损伤或修复等)和分子运输能力(透过膜的微粒数量等)产生变化，使细胞膜穿孔而影响其通透性。 运用传递理论以及质量守恒原理，建立了超声作用大肠杆菌膜变化的动力学模型：E(t)=k3T-k1/k2+k3·e-(k2+k3)·t+k2T-k1/k2+k3 通过与实验结果模拟表明，该模型对膜变化过程具有很好的预测功能，能反映膜变化的实际过程。 超声在溶液中产生空化现象，超声作用主要归结于超声的空化效应和机械效应。促进溶质的扩散，提高了传质系数，增大了传质界面积，传质推动力变大，从而在整体上对细胞膜通透性有增加效应。 实验检测与详细的理论探讨表明：超声可提高细胞膜通透性，主动力是超声的空化效应及机械效应。电镜观察膜变化过程有脂双分子层变形效应、有‘穿孔’效应。利用所建立的拟合方程推算出超声作用提高膜的传质速率常数，进一步证实超声提高膜通透性的机理。 本论文将新兴的超声技术应用于生物医学领域，对超声影响大肠杆菌细胞膜通透性的因素、作用效果、与化学方法的比较、膜变化过程的动力学模型及其机理进行系统的研究，并优化了最佳的工艺参数，对进一步深入研究物理场影响细胞膜通透性具有重要的理论意义与实际意义。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1大肠杆菌简介

1.2细胞膜通透性的重要性

1.3细胞膜

1.3.1细胞膜的组成

1.3.2细胞膜的结构

1.3.3生物膜的功能

1.4改变通透性的方法

1.4.1化学法

1.4.2物理法

1.5超声波与细胞膜通透性

1.5.1超声波

1.5.2超声波与细胞膜通透性

1.5.3研究现状存在的问题

1.6功率超声的作用机制及设备

1.6.1功率超声的作用机制

1.6.2功率超声的作用方式

1.6.3超声波作用效果的影响因素

1.6.4超声波处理设备

1.6.5小结

1.7本研究的重要意义和主要研究内容

1.7.1本研究的重要意义

1.7.2主要研究内容

第二章大肠杆菌的培养及超声处理

2.1前言

2.2材料与试剂

2.2.1菌种

2.2.2试剂

2.3实验仪器与设备

2.4超声作用装置

2.4.1清洗槽式超声波作用装置[70]

2.4.2变幅杆浸入式超声波作用装置

2.5实验方法

2.5.1大肠杆菌的培养

2.5.2大肠杆菌对数生长期的测定

2.5.3超声处理方法

2.5.4存活率的测定

2.6结果与讨论

2.6.1大肠杆菌生长曲线

2.6.2大肠杆菌菌落

2.6.3超声对大肠杆菌生存率的影响

2.7 小结

第三章超声波对大肠杆菌细胞膜通透性的影响

3.1前言

3.2材料

3.3试剂与仪器

3.3.1试剂

3.3.2仪器

3.4处理方法

3.4.1化学处理法

3.4.2超声处理方法

3.5分析方法

3.5.1 FDA荧光的测定

3.5.2细胞胞内蛋白质的测定

3.6结果与讨论

3.6.1FDA荧光分析

3.6.2化学法处理结果与讨论

3.6.3变幅杆浸入式超声对细胞膜通透性的影响

3.6.4变幅杆浸入式超声作用间隙时间对细胞膜通透性的影响

3.6.5变幅杆浸入式超声的不同电功率对细胞生存率的影响

3.6.6清洗槽式超声对细胞膜通透性的影响

3.6.7最佳超声工艺参数的确定

3.7小结

第四章荧光探针法探讨细胞膜通透性

4.1前言

4.2实验仪器与方法

4.2.1主要仪器与试剂

4.2.2分析方法

4.3实验结果与讨论

4.3.1大肠杆菌存活率分析

4.3.2荧光显微镜观察分析

4.3.3荧光分析

4.4小结

第五章电镜显微技术探讨细胞膜通透性

5.1前言

5.2超声在溶剂中空化现象的检测

5.3实验仪器与方法

5.3.1主要仪器

5.3.2样品超声处理

5.3.3扫描电镜样品制备

5.3.4透射电镜样品制备

5.4结果

5.4.1扫描电镜观察结果与分析

5.4.2透射电镜观察结果与分析

5.5讨论

5.5.1超声使膜功能性改变

5.5.2超声导致细胞膜穿孔

5.5.3超声穿孔引起的膜结构变化

5.5.4膜穿孔的复原

5.6小结

第六章超声影响细胞膜通透性动力学模型的研究

6.1前言

6.2动力学模型的基本假设

6.3膜通透性动力学模型的建立

6.4动力学模型的模拟

6.5小结

结论与展望

参考文献

攻读博士期间发表的论文

致谢