非水介质中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的研究

摘要

5-氟尿苷(5-FUR)是一种具有较高抗肿瘤活性的非天然核苷，但其在应用中尚存在脂溶性差、在血浆中半衰期短等缺点。利用5-氟尿苷的酰化反应可解决上述问题，获得比原药具有更高抗肿瘤活的5-氟尿苷单酯。此外，5-氟尿苷的酰化反应也是核苷化学中重要的基团保护反应之一，因此该反应具有重要的研究价值。然而，目前5-氟尿苷的酰化主要采用化学法，存在区域选择性差、反应步骤复杂、环境不友好等诸多问题。迄今，仅有一篇酶促5-氟尿苷酰化反应的报道，且其达到的反应速度和区域选择性均不甚理想。基于以上情况，本论文首次探讨了酶促5-氟尿苷与不同羧酸乙烯酯进行区域选择性酰化反应的可行性，并对比研究了不同反应介质中各影响因素对不同脂肪酶催化5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响规律，阐明了不同介质中酶促反应的特性；在此基础上，建立可用于高效、高区域选择性地合成5-氟尿苷单酯的生物催化反应体系。 来源于Candida antarctica的固定化脂肪酶。Novozym 435和来源于Thermomyces lanuginosus的固定化脂肪酶Lipozyme TL IM均能在非水介质体系中高效、高区域选择性地催化5-氟尿苷5-羟基酰化反应。Novozym 435适宜催化5-氟尿苷5-短链脂肪酸酯合成；价格相对低廉的Lipozyme TL IM在催化5-氟尿苷5-长链脂肪酸酯合成时更具优势。来源于Burkholderia cepacia的固定化脂肪酶PSL-C为合成5-氟尿苷3-脂肪酸酯较适宜的催化剂。构效分析表明这三种酶的选择性与其活性中心结构及反应底物结构之间有着较好的相关性。 适宜Novozym 435、Lipozyme TL IM和PSL-C催化5-氟尿苷酰化反应的纯有机溶剂、混合有机溶剂和含离子液体介质依次分别是乙腈、20％(v/v)四氢呋喃-丙酮、5％(v/v)C4MIm.PF6-丙酮；乙腈、15％(v/v)四氢呋喃一丙酮、8％(v/v)C4MIm．PF6-丙酮；1，4-二（口恶）烷、18％(v/v)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)-四氢呋喃(THF)、8％(v/v)C4MIm.BF4-THF。 在乙腈、20％(v/v)四氢呋喃-丙酮或5％(v/v)C4MIm．PF6-丙酮中，Novozym 435催化5-氟尿苷丙酰化反应的初速度和底物转化率受各反应因素的影响规律因反应介质的不同而异，然各因素对反应区域选择性的影响甚微，在所研究的范围内，该反应的区域选择性始终高于99％。在上述三种介质中酶促反应的最适初始水活度、5-氟尿苷浓度、两底物摩尔比、反应温度和振荡速度依次分别为：0.07、20 mmol/L、1：15、55℃和200r/min；0.07、90mmol/L、1：15、55℃和200 r/min；0.07、lOOmmol/L、1：15、55℃和250 r/min。在上述条件下，反应初速度和底物最大转化率依次分别为108.2 mmol/L.h和99.1％：103.4 mmol/L.h和98.6％；101.3 mmol/L.h和98.5‰与之相对应的是在乙腈中Novozym 435促5-氟尿苷丙酰化反应的表观活化能最低。在乙腈、15％(v/v)四氢呋喃-丙酮和8％(v/v)C4MIm-PF6-丙酮三种反应体系中，Lipozyme TL IM促5-氟尿苷月桂酰化反应的初速度和底物转化率受各反应因素的影响规律因反应介质的不同而异，然各因素对反应区域选择性的影响甚微，在所研究的范围内，该反应的区域选择性始终高于99％。在上述三种介质中该酶促反应的最适初始水活度、5-氟尿苷浓度、两底物摩尔比、反应温度和振荡速度依次分别为：0.07、20mmol/L、1：15、45℃和200 r/min；0.07、90mmol/L、l：15、40℃和200 r/min；0.07、100mmol/L、1：15、45℃和250 r/min。在上述条件下，反应初速度和底物最大转化率依次分别为79.8mmol/L.h和98.8％；84.7 mmol/L.h和98.6％，71.7 mmol/L.h和98.5％；与之相对应的是在15％(v/v)四氧呋喃-丙酮中酶促5-氟尿苷月桂酰化反应的表观活化能最低。 在1，4-二（口恶）烷、18％(v/v)DMF-THF和8％(v/v)C4MImBF4-THF三种反应体系中，各反应因素对PSL-C促5-氟尿苷丙酰化反应的初速度、底物最大转化率和反应的3-区域选择性的影响因反应介质的不同而异。在上述介质中该酶促反应的最适初始水活度、两底物摩尔比、反应温度、振荡速度和5-氟尿苷浓度依次分别为：0.07、1：15、50℃、200 r/min和120 mmol/L；1：15、0.07、50℃、200 r/min和200 mmol/L；1：15、0.07、55℃、250 r/min和120 mmol/L。在上述条件下，反应初速度、底物最大转化率和3-区域选择性依次分别为27.4 mmol/L.h、98.5％和73.6％；21.4 mmol/L.h、98.4％和76.5％和46.4 mmol/L.h、98.6％和79.6％；与之相对应的是在8％(v/v)C4MIm'BF4-THF中PSL-C促5-氟尿苷丙酰化反应的表观活化能最低。 酰基供体结构对酶促5-氟尿苷酰化反应的影响规律因酶不同而异，对脂肪酶Novozym 435而言，随着酰基部分脂肪酸碳链长度增加(除乙酸乙烯酯外)，酶促5-氟尿苷酰化反应的初速度不断下降，底物最大转化率随之略有波动。而对于脂肪酶Lipozyme TL IM，随着酰基供体酰基部分碳链的碳原子个数从2增加至12，酶促5-氟尿苷酰化反应的底物最大转化率和反应速度均显著增加；当脂肪酸碳链(C12～C18)进一步加长时，酶促反应速度随之下降，但底物最大转化率变化甚微。以该两种酶为催化剂，反应的5’．区域选择性均高达99％以上。脂肪酶PSLC为催化剂时，酰基供体酰基部分碳链的碳原子个数从2增加至3，反应的底物最大转化率、反应速度和3-区域选择性均随之显著提高。当脂肪酸碳链长度进一步增加时，酶促反应速度、底物最大转化率和3-区域选择性却随之下降。在不同的反应介质中，酰基供体结构对相同酶促5-氟尿苷酰化反应的影响规律一致。离子液体的种类对酶促5-氟尿苷酰化反应有着不同程度的影响，其中阴离子的种类对该酶促反应的影响较为显著，在所考察的离子液体中，Novozym 435和Lipozyme TLIM促5-氟尿苷酰化反应在含阴离子PF6的离子液体介质中的催化活性最高；PSL.C促5-氟尿苷酰化反应在含阴离子BF4的离子液体介质中的催化活性最高；而当阴离子为NO3、Cl、Br时，所研究的三种脂肪酶均未表现出酰化活性。离子液体显著提高了酶的稳定性，在含离子液体介质中，所研究的三种脂肪酶的热稳定性和操作稳定性最高。 利用所建立的生物催化反应体系合成5-氟尿苷单酯，反应速度、底物转化率及反应的区域选择性均远高于现有报道的对应值。 本研究不仅丰富了酶学基础理论知识，还开辟了一条可用于5-氟尿苷高效、高区域选择性酰化的新途径。

目录

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声明

第一章绪论

1.1非水介质中的酶促生物催化与生物转化

1.1.1非水介质中酶促生物催化与生物转化的特点

1.1.2适用于酶催化的非水介质体系

1.1.3影响非水介质中酶促反应的主要因素

1.1.4酶在非水介质中的一些特殊性质

1.2酶促核苷类化合物的酰化反应

1.2.1催化核苷酰化反应的酶

1.2.2酰基供体的选择

1.2.3反应介质对酶促核苷酰化反应的影响

1.2.4酶促核苷类化合物酰化反应的应用

1.2.5酶促核苷类化合物酰化反应研究的现状和前景

1.3 5-氟尿苷酯类衍生物的重要性及其合成

1.3.1 5-氟尿苷及其酯类衍生物

1.3.2国内外5-氟尿苷酯类衍生物的合成现状

1.4本研究的主要内容和意义

第二章催化5-氟尿苷区域选择性酰化反应酶的筛选及其反应产物的表征

2.1实验材料

2.1.1酶

2.1.2主要试剂

2.2主要仪器设备

2.3实验方法

2.3.1有机溶剂脱水

2.3.2反应初始水活度的控制

2.3.3不同来源的水解酶催化5-氟尿苷丙酰化反应

2.3.4不同来源的水解酶催化5-氟尿苷月桂酰化反应

2.3.5不同来源的水解酶促5-氟尿苷硬脂酰化反应

2.3.6高效液相色谱(HPLC)分析

2.3.7反应初速度、底物最大转化率、区域选择性的计算

2.3.8产物的分离纯化

2.3.9产物的结构分析

2.4结果与讨论

2.4.1不同来源的酶催化5-氟尿苷酰化反应的活性

2.4.2不同来源的酶催化5-氟尿苷酰化反应的区域选择性

2.5本章小结

第三章有机溶剂中Novozym 435促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的研究

3.1实验材料

3.1.1酶

3.1.2主要试剂

3.2主要仪器设备

3.3实验方法

3.3.1有机溶剂脱水

3.3.2反应体系初始水活度的控制

3.3.3高效液相色谱分析

3.3.4反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算

3.3.5不同溶剂中底物溶解度的测定

3.3.6有机溶剂种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.7酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.8不同有机溶剂中酶残留活性的测定

3.3.9初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.10底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.11反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.12振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.3.13酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的反应曲线测定

3.3.14纯有机溶剂中酶的热稳定性研究

3.3.15纯有机溶剂中酶的操作稳定性研究

3.4结果与讨论

3.4.1有机溶剂种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.2酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.3初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.4底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.5反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.6振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.7反应时间对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

3.4.8有机溶剂中酶的稳定性研究

3.5本章小结

第四章混合有机溶剂中脂肪酶Novozym435促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的研究

4.1实验材料

4.1.1酶

4.1.2主要试剂

4.2主要仪器设备

4.3实验方法

4.3.1有机溶剂脱水

4.3.2反应体系初始水活度的控制

4.3.3高效液相色谱分析

4.3.4反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算

4.3.5不同混合溶剂中底物溶解度的测定

4.3.6混合有机溶剂种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.7混合有机溶剂中四氢呋喃浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.8溶剂极性参数ET(30)的测定

4.3.9酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.10初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.11 5-氟尿苷浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.12底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.13反应体系中乙醛、丙酸等副产物的GC-MS检测

4.3.14反应体系中添加分子筛对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.15反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.16振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.3.17混合有机溶剂中酶的热稳定性研究

4.3.18混合有机溶剂中酶的操作稳定性研究

4.4结果与讨论

4.4.1混合有机溶剂种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.2混合有机溶剂中四氢呋喃浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.3有机介质的溶剂参数与Novozym 435催化活性及选择性的关系

4.4.4酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.5初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.6 5-氟尿苷浓度对混合溶剂中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.7底物摩尔比对混合溶剂中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.8反应体系中过量酰基供体对酶促反应特性影响的机理

4.4.9反应温度对混合溶剂中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.10振荡速度对混合溶剂中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

4.4.11混合有机溶剂中酶的稳定性研究

4.5本章小结

第五章含离子液体介质中Novozym 435促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的研究

5.1实验材料

5.1.1酶

5.1.2主要试剂

5.2主要仪器设备

5.3实验方法

5.3.1有机溶剂脱水

5.3.2反应体系初始水活度的控制

5.3.3高效液相色谱分析

5.3.4反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算

5.3.5有机溶剂与离子液体的互溶性

5.3.6不同含离子液体介质中5-氟尿苷溶解度的测定

5.3.7离子液体种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.8离子液体浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.9酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.10初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.11 5-氟尿苷浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.12底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.13反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.14振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.3.15不同反应介质中酶促5-氟尿苷酰化反应的表观活化能之比较

5.3.16含离子液体介质中Novozym 435的热稳定性研究

5.3.17含离子液体介质中Novozym 435的操作稳定性研究

5.4结果与讨论

5.4.1离子液体种类对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.2离子液体浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的研究

5.4.3酰基供体对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.4初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.5 5-氟尿苷浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.6两底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.7反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.8振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

5.4.9不同反应介质中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的表观活化能之比较

5.4.10含离子液体介质中Novozym 435稳定性的研究

5.5本章小结

第六章脂肪酶Lipozyme TL IM促5-氟尿苷5’-脂肪酸酯合成的研究

6.1实验材料

6.1.1酶

6.1.2主要试剂

6.2主要仪器设备

6.3实验方法

6.3.1有机溶剂脱水

6.3.2反应体系初始水活度的控制

6.3.3高效液相色谱分析

6.3.4反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算

6.3.5不同溶剂中5-氟尿苷溶解度的测定

6.3.6反应介质对脂肪酶Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.7不同有机溶剂中Lipozyme TL IM残留活性的测定

6.3.8酰基供体对Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.9初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.10 5-氟尿苷浓度对Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.11底物摩尔比对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.12反应温度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.13振荡速度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.3.14不同反应介质中Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的表观活化能之比较

6.3.15不同反应介质中Lipozyme TL IM的热稳定性之研究

6.3.16不同反应介质中Lipozyme TL IM的操作稳定性之研究

6.4结果与讨论

6.4.1反应介质对Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.2酰基供体对不同反应介质中Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.3初始水活度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.4 5-氟尿苷浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.5底物摩尔比对不同反应介质中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.6反应温度对Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.7振荡速度对Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

6.4.8不同反应介质中Lipozyme TL IM促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的表观活化能之比较

6.4.9不同反应介质中Lipozyme TL IM的稳定性之比较

6.5本章小结

第七章脂肪酶PSL-C促5-氟尿苷3’-脂肪酸酯合成的研究

7.1实验材料

7.1.1酶

7.1.2主要试剂

7.2主要仪器设备

7.3实验方法

7.3.1有机溶剂脱水

7.3.2反应体系初始水活度的控制

7.3.3高效液相色谱分析

7.3.4反应初速度、底物转化率、区域选择性的计算

7.3.5不同溶剂中5-氟尿苷溶解度的测定

7.3.6不同反应介质对PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.7酰基供体对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.8初始水活度对不同反应介质中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.9底物摩尔比对不同反应介质中酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.10反应温度对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.11振荡速度对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.12 5-氟尿苷浓度对PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.3.13不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷酰化反应表观活化能之比较

7.3.14不同反应介质中PSL-C的热稳定性之研究

7.3.15不同反应介质中PSL-C的操作稳定性之研究

7.4结果与讨论

7.4.1不同反应介质对PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.2酰基供体对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.3初始水活度对PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.4两底物摩尔比对PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.5反应温度对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.6振荡速度对不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.7 5-氟尿苷浓度对酶促5-氟尿苷区域选择性酰化反应的影响

7.4.8不同反应介质中PSL-C促5-氟尿苷酰化反应表观活化能之比较

7.4.9不同反应介质中脂肪酶PSL-C的稳定性之比较

7.5本章小结

结论与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢