裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化及其活性研究

摘要

裂褶多糖(SPG)是药用真菌裂褶菌产生的一种中性胞外多糖,具有显著的抗肿瘤、调节免疫功能和抗辐射等活性。天然裂褶多糖由于分子量大在水中溶解度小、粘度大,人体不易吸收,生物利用度低,严重影响了其生物活性的发挥。因此有必要降低其分子量对其改性。酶法反应条件温和、容易控制,而且,利用酶法鉴别生物多糖的结构并对其结构进行定向降解、重组、修饰来获取新型糖类生化药物是一个新的研究热点。本论文研究采用合适的内切酶对裂褶多糖进行降解。 本论文从裂褶菌中分离得到一株内切β-1,3-葡聚糖酶,并对内切β-1,3-葡聚糖酶的培养条件优化、分离纯化和酶学性质等展开了系统的研究,探讨了该酶降解裂褶多糖的规律性。该研究将为生物活性多糖改性新方法的建立提供必要的基础数据和理论基础,对于促进抗癌新药的研制以及人们健康水平的提高都具有重要的理论意义和实践价值。 主要研究内容和结果如下： 1.裂褶菌培养及产内切β-1,3-葡聚糖酶条件优化采用恒温摇床培养法培养裂褶菌,通过对培养基组成中的碳源、氮源及无机盐作了单因素试验,并在此基础上采用正交试验对主要影响因素进行了分析,从而找到最佳的产酶培养基配方：葡萄糖2％,牛肉膏0.3％,NH4Cl 0.1％,KH2PO4 0.05％,MgSO4 0.05％。接着对培养条件进行了优化试验,包括培养温度、起始pH值、装液量、接种量和培养时间,得到该菌株产内切β-1,3-葡聚糖酶的最佳培养条件为：初始pH值为7.0,温度为30℃,装液量为80 mL/250 mL,接种量为2.0 mL(孢子浓度为106个/mL),培养时间为6 d。 2.内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化裂褶菌发酵液经过硫酸铵盐析,当饱和度为80％时出现最大盐析峰,但是饱和度为70％时酶活达到最高,因此确定硫酸铵最佳饱和度为70％,再经过硫酸铵40％～70％分段盐析、透析浓缩后、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤进行内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化,经过纯化后内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90 U/mg提高到933.37 U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6％。浓缩含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析,酶蛋白呈单一条带,分子量近似为45 kD。 3.内切β-1,3-葡聚糖酶的酶学性质的研究采用还原糖法和活性染料法共同测定内切β-1,3-葡聚糖酶的酶活,研究其酶学性质。内切β-1,3-葡聚糖酶的最适pH是5.0,最适温度为45℃,酸碱稳定性范围是4.5～5.5,热稳定性范围在55℃以下。内切β-1,3-葡聚糖酶有严格的底物专一性,只对含有β-1,3糖苷键的底物SPG起作用,对含有β-1,4糖苷键的CMC-Na水解作用极低,对含有α-1,6糖苷键的Dextran和α-1,4糖苷键的可溶性淀粉没有作用。Cu2+、Fe2+、Ba2+对该酶有一定的激活作用,Zn2+、K+、Ag+、Hg2+、ca2+对该酶有一定的抑制作用。以裂褶多糖为底物,测定最大反应速度Vm=0.3903 mg/mL·min,该酶的米氏常数Km=0.8813 mg/mL.。经过圆二色谱测定,内切β-1,3-葡聚糖酶各二级结构的含量分别为：α-螺旋4.6％、β-折叠49.1％、β-转角8.7％、无规则卷曲37.5％。 4.内切β-1,3-葡聚糖酶降解裂褶多糖规律的研究采用凝胶渗透色谱法(GPC)对内切β-1,3-葡聚糖酶降解裂褶多糖的规律进行研究,经过GPC检测,SPG溶液洗脱曲线呈现单一峰,数均分子量Mn=3.45×106,重均分子量Mw=6.58×106。分别对酶解反应温度、反应时间和酶液用量等影响因素进行探讨,从而确定最佳酶解反应温度为50℃,最佳酶液用量为4 mL酶解裂褶多糖的时间控制在2小时以内可取得较好的效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1裂褶菌研究进展

1.1.1裂褶菌简介

1.1.2裂褶菌培养及深层发酵

1.2裂褶多糖研究进展

1.2.1裂褶多糖简介

1.2.2裂褶多糖的食药用价值

1.2.3裂褶多糖的改性方法

1.3 β-1，3-葡聚糖酶研究进展

1.3.1 β-1，3-葡聚糖酶的来源及基本性质

1.3.2裂褶菌产β-1，3-葡聚糖酶的研究进展

1.3.3 β-1，3-葡聚糖酶的酶活力测定方法

1.3.4 β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化

1.4本研究的立题背景、研究意义和主要研究内容

第二章 裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养条件的优化

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1菌株

2.2.2主要试剂

2.2.3仪器与设备

2.2.4培养基与培养条件

2.2.5酶解底物的制备

2.2.6酶活力测定方法

2.3结果与讨论

2.3.1裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养基组成的优化

2.3.2裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的条件优化

2.4本章小结

第三章内切β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1原料

3.2.2主要试剂与材料

3.2.3仪器与设备

3.3实验方法

3.3.1蛋白质含量的测定

3.3.2酶活力的测定方法

3.3.3内切β-1，3-葡聚糖酶的提取

3.3.4硫酸铵盐析

3.3.5 DEAE-Sephadex A.50柱层析

3.3.6 Sephadex G-75柱层析

3.3.7 SDS-PAGE电泳纯度鉴定

3.4结果与讨论

3.4.1蛋白质浓度的测定

3.4.2最佳盐析条件的确定

3.4.3硫酸铵分段盐析

3.4.4 DEAE-Sephadex A-50柱层析

3.4.5 Sephadex G-75柱层析

3.4.5电泳纯度鉴定

3.4.6内切β-1，3-葡聚糖酶分离纯化的基本流程

3.5本章小结

第四章 内切β-1，3-葡聚糖酶的酶学性质研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1原料

4.2.2主要试剂

4.2.3仪器与设备

4.3实验方法

4.3.1酶活力的测定方法

4.3.2内切β-1，3-葡聚糖酶最适pH值的确定

4.3.3内切β-1，3-葡聚糖酶最适反应温度的确定

4.3.4内切β-1，3-葡聚糖酶的酸碱稳定性

4.3.5内切β-1，3-葡聚糖酶的热稳定性

4.3.6金属离子对酶活力的影响

4.3.7内切β-1，3-葡聚糖酶的底物专一性

4.3.8内切β-1，3-葡聚糖酶的动力学常数的测定

4.3.9内切β-1，3-葡聚糖酶的圆二色性

4.4结果与讨论

4.4.1内切β-1，3-葡聚糖酶最适pH值的确定

4.4.2内切β-1，3-葡聚糖酶最适反应温度的确定

4.4.3内切β-1，3-葡聚糖酶的酸碱稳定性

4.4.4内切β-1，3-葡聚糖酶的热稳定性

4.4.5金属离子对酶活力的影响

4.4.6内切β-1，3-葡聚糖酶的底物专一性

4.4.7内切β-1，3-葡聚糖酶的动力学常数测定

4.4.8内切β-1，3-葡聚糖酶的圆二色性

4.4本章小结

第五章 内切β-1，3-葡聚糖酶活性研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1原料

5.2.2主要试剂

5.2.3仪器与设备

5.3实验方法

5.3.1不同反应温度的影响

5.3.2不同反应时间的影响

5.3.3不同酶液用量的影响

5.3.3样品前处理

5.3.4色谱条件

5.3.5校正曲线的制作

5.4结果与讨论

5.4.1裂褶多糖的分子量测定

5.4.2不同反应温度的影响

5.4.3不同反应时间的影响

5.4.4不同酶液用量的影响

5.5本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢