南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其非水相催化应用

摘要

脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3)以其来源广、催化功能多以及催化底物广泛的优势成为生物技术及有机合成方面研究最广泛的一类酶。迄今为止,在众多脂肪酶中,南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的用途最为广泛,它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近几年的研究成果表明,CALB以及Novozyme 435(吸附固定于大孔丙烯酸树脂的CALB)在酯化、水解、转酯、以及其它类型反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。但是采取吸附法固定,机械搅拌或磁力搅拌都容易使Novozyme 435在反应过程中出现酶脱落甚至固定化颗粒破碎的情况,这也是固定化酶面临的普遍问题。本研究利用酵母表面展示系统中的天然表面展示蛋白α-凝集素将CALB锚定于酿酒酵母MT8-1细胞表面,可较好的解决上述问题。而且利用该系统生产酶制剂,绕过酶分离纯化的复杂操作程序,直接离心收集菌体,即可得到纯度较高的全细胞酶制剂。 本研究首先根据NCBI上报道的CALB序列(来源于C.antarctica LF 058菌株,Accession Z30645),设计特异性的引物,从南极假丝酵母基因组中扩增出CALB的完整编码基因,并将其连接到酿酒酵母表面展示载体pICAS上。重组质粒经DNA测序,结果表明:CALB成熟肽完整编码区已正确插入到表面展示载体pICAS上,在启动子GAPDH控制下,位于葡糖淀粉酶信号肽及α-凝集索C端序列之间,CALB编码基因与NCBI上报道的序列同源性达99％,与Michiko Kato等克隆的CALB编码基因有较大区别。 为了使锚定蛋白α-凝集素不干扰CALB酶蛋白的正确折叠,使其能形成天然的活性构象,根据文献报道,celA的天然连接肽与CALB酶蛋白有很好的相容性,本研究对酵母表面展示载体pICAS进行了改造。在多克隆位点和α-凝集素基因之间引入天然连接肽celA Linker的编码基因。然后利用连接肽celA Linker将CALB与α-凝集素的C端连接,构建表面展示载体pICAS-celAL-CALB,转化酵母获得重组酵母菌Saccharomyces cerevisiae pICAS-celAL-CALB。该重组酵母菌经葡萄糖诱导表达,分析结果表明CALB已在酿酒酵母细胞表面成功展示。在SDC液体培养基中发酵,随着菌体数量的增加,酶活力逐渐增大,48h后重组菌株S.cerevisiae pICAS-celAL-CALB进入生长稳定期,但仍继续产酶,直到发酵96 h脂肪酶活力达到最高值68.18 U/L(约28.65U/g-dry cell)。该重组酿酒酵母经过近200h的连续传代培养,仍未发生基因丢失现象,证明该重组菌株具有很好的遗传稳定性。对于这一有潜在应用价值的新型酶制剂,有必要对其一般酶学性质进行研究,找出最适反应条件,为进一步的应用提供依据。酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性,以对硝基苯酚酯为反应底物,酵母表面展示CALB的最适反应pH值范围为8.0～8.5,最适反应温度范围为40～45℃,最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,对不同碳链长度的反应底物表现出极为明显的底物特异性。Ca2+、Mg2+对其有明显的激活作用。K+对其有微弱的激活作用。而Co2+、Cu2+对其有明显的抑制作用。 在以正庚烷为溶剂的非水相反应体系中,表面展示CALB重组酿酒酵母菌体冻干粉能有效的催化己酸和乙醇酯化生成己酸乙酯。通过对影响该酯化反应的几个参数的研究发现最适反应条件为：酯化温度范围为40℃,底物酸醇摩尔比范围为1:1.25到1:1.5,底物中己酸含量范围为0.2 mol/L到0.6 mol/L,全细胞酶制剂用量为60 g/L。添加适量分子筛,反应24h后,己酸的摩尔转化率可超过98％。反应后离心回收菌体,经溶剂正庚烷洗涤,去除产物和残余的微量底物,再加入到含有新鲜底物的反应体系中催化酯化反应,经过10批次的连续使用,酿酒酵母展示CALB对己酸的转化率仍然保持在95％以上,说明其在该反应体系中具有很好的操作稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1脂肪酶

1.1.1脂肪酶概述

1.1.2脂肪酶的结构与催化性质

1.2南极假丝酵母脂肪酶B

1.2.1南极假丝酵母脂肪酶B的分子生物学特性

1.2.2南极假丝酵母脂肪酶B的蛋白质工程研究

1.2.3南极假丝酵母脂肪酶B的反应机制和催化反应过渡态推测

1.2.4南极假丝酵母脂肪酶B的立体选择性

1.3酵母表面展示

1.3.1酵母表面展示系统概述

1.3.2酵母表面展示系统的类型

1.3.3酵母表面展示的应用

1.4本课题的研究意义与内容

第二章Candida antarctica lipase B基因的克隆

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.2.1实验仪器

2.2.2载体与菌株

2.2.3酶及主要试剂

2.2.4溶液配制

2.2.5培养基

2.3实验方法

2.3.1 Candida antarctica总DNA的提取

2.3.2 Candida antarctica lipase B基因的扩增

2.3.3 PCR产物纯化

2.3.4纯化后的PCR产物双酶切

2.3.5酶切后目的产物的凝胶回收

2.3.6载体pICAS的双酶切及其纯化

2.3.7目的基因CALB与pICAS载体的连接

2.3.8 CaCl2法制备大肠杆菌感受态

2.3.9重组质粒pICAS-CALB的转化

2.3.10重组质粒的鉴定

2.3.11 CALB基因的测序

2.4结果及讨论

2.4.1基因组DNA的提取

2.4.2 CALB基因的扩增结果

2.4.3重组质粒pICAS-CALB的构建及鉴定

2.4.4 CALB基因的分析

2.5小结

第三章细胞表面展示CALB的酿酒酵母工程菌的构建

3.1引言

3.2技术路线

3.2.1酿酒酵母表面展示表达载体pICAS-celALB的构建示意图

3.2.2酿酒酵母表面展示表达载体pICAS-celAL-CALB的构建示意图

3.3实验材料与仪器

3.3.1实验仪器

3.3.2载体与菌株

3.3.3酶及主要试剂

3.3.4溶液配制

3.3.5培养基

3.4实验方法

3.4.1连接肽celA Linker编码基因的全合成

3.4.2 pMD18-T-celAL载体的双酶切

3.4.3 pICAS-CALB的双酶切

3.4.4连接肽编码基因celAL与pICAS载体的连接

3.4.5重组质粒pICAS-celAL转化大肠杆菌感受态

3.4.6重组质粒pICAS-celAL的抽提

3.4.7重组质粒pICAS-celAL的酶切鉴定

3.4.8重组质粒pICAS-celAL的双酶切

3.4.9 CALB编码基因与pICAS-celAL载体的连接

3.4.10重组质粒pICAS-celAL-CALB转化大肠杆菌感受态

3.4.11重组质粒pICAS-celAL-CALB的抽提

3.4.12重组质粒pICAS-CALB-CALB的酶切鉴定

3.4.13重组质粒pICAS-celAL-CALB中celAL和CALB基因的测序

3.4.14 pICAS-celAL-CALB重组质粒的线性化

3.4.15酿酒酵母MT8-1化转感受态细胞的制备

3.4.16化学法转化酿酒酵母MT8-1

3.4.17阳性转化子的油脂平板筛选

3.4.18阳性转化子的菌落PCR鉴定

3.4.19重组酿酒酵母菌株的遗传稳定性

3.4.20采用吸光度法测定脂肪酶活力

3.5结果及讨论

3.5.1 CALB酵母表面展示载体的构建

3.5.2 pICAS-celAL-CALB酿酒酵母工程菌的构建

3.5.3三丁酸甘油酯平板筛选

3.5.4液体试管发酵产酶复筛

3.5.5阳性重组菌株的菌落PCR鉴定

3.5.6重组酿酒酵母生长曲线和产酶曲线的测定

3.5.7重组酿酒酵母菌株的遗传稳定性

3.6小结

第四章酿酒酵母表面展示CALB的酶学性质研究

4.1引言

4.2实验材料与仪器

4.2.1实验仪器

4.2.2菌株

4.2.3主要试剂

4.2.4培养基

4.3实验方法

4.3.1酿酒酵母表面展示CALB的制备

4.3.2酿酒酵母表面展示CALB酶活力测定

4.3.3酿酒酵母表面展示CALB的最适pH和pH稳定性

4.3.4酿酒酵母表面展示CALB的最适温度和温度稳定性

4.3.5金属阳离子对酿酒酵母表面展示CALB水解活性的影响

4.3.6酿酒酵母表面展示CALB的底物特异性

4.4结果及讨论

4.4.1 pH对酿酒酵母表面展示CALB水解活性的影响

4.4.2 pH对酿酒酵母表面展示CALB稳定性的影响

4.4.3反应温度对酿酒酵母表面展示CALB水解活性的影响

4.4.4酿酒酵母表面展示CALB的热稳定性

4.4.5不同金属阳离子对酿酒酵母表面展示CALB的水解活性的影响

4.4.6酿酒酵母表面展示CALB底物特异性

4.5小结

第五章酿酒酵母表面展示CALB催化合成己酸乙酯

5.1引言

5.2实验材料与仪器

5.2.1实验仪器

5.2.2菌株

5.2.3主要试剂

5.2.4培养基

5.3实验方法

5.3.1酿酒酵母表面展示CALB全细胞催化剂的制备

5.3.2非水相酯化反应

5.3.3产物的气相色谱分析

5.4结果及讨论

5.4.1真空冷冻干燥对酿酒酵母表面展示CALB活力的影响

5.4.2酿酒酵母表面展示CALB催化合成己酸乙酯反应曲线

5.4.3酵母菌体冻干粉用量对酯化反应的影响

5.4.4温度对全细胞催化酯化反应的影响

5.4.5底物浓度和摩尔比对全细胞催化酯化反应的影响

5.4.6酿酒酵母表面展示CALB全细胞催化剂的操作稳定性

5.5小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢

附录