骨唾液酸蛋白在人乳腺癌细胞中的表达与血管侵袭的关系

摘要

骨是乳腺癌最常见的远处转移部位之一,乳腺癌溶骨性骨转移的发生率约为70％。乳腺癌骨转移不但涉及一般肿瘤转移的共同步骤,还与乳腺癌细胞具有靶向骨转移的特性有关。乳腺癌细胞可以和细胞外基质、内皮细胞、血小板、间质细胞及组织特异性结构发生相互作用。研究表明细胞外基质磷酸糖蛋白SIBLINGs家族(small integrin-bindingligand N-linked glycoproteins,SIBLINGs)及其整合素受体在转移中发挥重要作用。乳腺癌细胞分泌甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP),刺激成骨细胞或基质细胞分泌转录因子kB配基受体激活剂(receptor activator of NF-kBligand,RANKL),通过破骨细胞前体表面的转录因子KB配基受体(receptor activator ofNF-kB,RANK)信号途径,刺激转录因子开始转录,导致破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞,使成骨细胞和破骨细胞间失去平衡,促进了骨吸收作用。 骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是细胞外基质中的一种高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,属于SIBLINGs蛋白家族。BSP在肿瘤的黏附、增殖、侵袭、基质降解、免疫反应(炎症和补体逃逸)、血管生成和转移中发挥重要的生物学作用。BSP与整合素αvβ3黏附、激活基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)、降解基质,通过活化特定细胞信号通路途径促进肿瘤的迁移。本研究检测BSP、αvβ3、RANK和PTHrP在3株具有不同转移性质的人乳腺癌细胞株的表达；以鸡胚尿囊绒膜(chorioallantoicmembrane,CAM)实验探讨BSP单克隆抗体(monoclonal antibody,Mab)对乳腺癌细胞血管侵袭能力的影响。主要实验结果如下： 1.亲骨转移人乳腺癌细胞(MDA-231BO,BO)的生长速率高于亲代(MDA-231P,231P)和亲脑转移人乳腺癌细胞(MDA-231BR,BR)。 2.细胞免疫组织化学检测结果表明MDA-231P、MDA-231BO和MDA-231BR细胞中BSP、αvβ3和RANK的表达呈阳性,表达部位主要为胞浆。 3.酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果提示MDA-231BO细胞培养上清中BSP和PTHrP的分泌表达量明显地高于MDA-231P和MDA-231BR。 4.逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测表明MDA-231BO细胞中BSP mRNA的表达水平最高,分别是MDA-231P和MDA-231BR细胞的1.58倍,3.54倍。 5.Western-Blotting检测提示MDA-231BO和MDA-231P细胞胞内BSP的表达水平高于MDA-231BR。 6.BSP Mab对MDA-231BO细胞的生长具有特异抑制作用,其抑制率和剂量呈正相关,BSPMab抗体浓度为100μg/ml时最大抑制率为35％±0.8％。 7.BSP Mab能特异性抑制MDA-231BO细胞穿透鸡胚CAM血管内皮细胞和基底膜,抑制效应与抗体浓度呈正相关。当BSP Mab浓度达到100μg/ml时能明显抑制MDA-231BO细胞侵入鸡胚血管。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一章 绪论

1.1乳腺癌骨转移机制的研究进展

1.1.1乳腺癌骨转移的相关因子

1.1.2乳腺癌骨转移的分子靶向治疗

1.2 BSP的研究现状

1.2.1 BSP的基因结构

1.2.2 BSP结构及功能特点

1.2.3 BSP的表达分布

1.2.4 BSP和肿瘤的关系

1.2.5 BSP作为肿瘤的预后指标

1.2.6 BSP作为肿瘤治疗药物靶点

1.3本课题研究背景及研究意义

1.4本课题的主要研究内容

第二章BSP、αvβ3、RANK和PTHrP在不同转移性质人乳腺癌细胞中的表达

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1细胞株

2.2.2主要试剂

2.2.3培养基和溶液

2.2.4主要仪器设备

2.3实验方法

2.3.1 MTT法测定细胞生长曲线

2.3.2免疫细胞组织化学检测BSP、αvβ3和RANK的表达

2.3.3 ELISA检测BSP和PTHrP的分泌表达

2.4统计方法

2.5结果与讨论

2.5.1不同转移性质人乳腺癌细胞生长曲线的比较

2.5.2乳腺癌细胞的BSP、αvβp3和RANK免疫组化检测结果

2.5.3细胞培养上清BSP和PTHrP的表达水平

2.6小结

第三章不同转移性质人乳腺癌细胞中BSP的mRNA和蛋白免疫印迹分析

3.1前言

3.2实验材料

3.2.1细胞

3.2.2主要试剂

3.2.3溶液

3.2.4主要仪器设备

3.3实验方法

3.3.1 RT-PCR测定细胞BSP mRNA的表达

3.3.2 SDS-PAGE和Western-Blotting检测细胞BSP蛋白表达

3.4统计方法

3.5结果与讨论

3.5.1不同转移性质人乳腺癌细胞中BSP mRNA表达情况

3.5.2不同转移性质人乳腺癌细胞中BSP蛋白表达情况

3.6小结

第四章 BSP单克隆抗体对亲骨转移人乳腺癌细胞血管侵袭能力的影响

4.1前言

4.2实验材料

4.2.1细胞和鸡胚

4.2.2主要试剂

4.2.3主要仪器设备

4.3实验方法

4.3.1 BSP单克隆抗体对MDA-231BO增殖的影响

4.3.2 PCR扩增MDA-231BO细胞的Alu基因

4.3.3鸡胚CAM测定BSP Mab对MDA-231BO细胞血管侵袭能力的影响

4.4统计方法

4.5结果与讨论

4.5.1 BSP Mab对MDA-23180细胞增殖的影响

4.5.2 MDA-231BO细胞中人Alu基因的PCR扩增

4.5.3 BSP Mab对MDA-231BO细胞血管侵袭能力的影响

4.6小结

结论与展望

结论

展望

本论文的创新之处

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢