白腐菌Flammulina velutipes漆酶的制备、性质及其应用于纸浆漂白的研究

摘要

本论文对毛柄金钱菌(Flammulina velutipes)漆酶的制备、纯化及理化性质及其应用于硫酸盐浆的漂白效果及机理进行了较为系统深入的研究。 以农业秸秆稻草为主要原料，采用微生物固体发酵方式，考察了F.velutipes的产酶体系以及碳源、氮源、诱导剂对F.velutipes合成漆酶的影响，并借助红外光谱对F.velutipes生物处理稻草前后的残余木素进行了分析，同时利用裂解-气质联用分析F.velutipes处理稻草过程中化学成分的变化。结果发现随着发酵时间延长，S/G数值逐渐减小，说明紫丁香基结构单元的降解程度比愈疮木基结构单元要高；木素/碳水化合物比值降低显著，说明该菌可以选择性地降解稻草木素；稻草裂解产物中紫丁香醛、紫丁香酮的比例提高，说明S和G型木质素单元Cα-Cβ键的氧化断裂。该结果证实了应用F.velutipes降解木素，进行纸浆漂白的潜力。 为进一步提高漆酶产量，本文研究了F．velutipes在液体振荡培养和液体静置条件下合成漆酶的情况，优化了F．velutipes合成漆酶的各种因素，探求其合成漆酶的最佳条件。在液体振荡培养条件下，无机氮源中酒石酸铵振荡培养所得漆酶的酶活力较高。有机氮源中蛋白胨的效果最好，比不加氮源的对照酶活提高50％，尿素的效果次之。Cu2+的浓度影响白腐菌F．velutipes漆酶的合成。随着Cu2+浓度增加，漆酶酶活呈先上升后下降的趋势，当Cu2+的浓度在0.8μmol/L时，漆酶产量达到最高峰值。添加Mn2+后，漆酶最高酶活力均提前至培养第五天。诱导剂中，香兰素诱导F．velutipes合成漆酶效果最为明显，培养至第9天，酶活达11320IU/L，比对照酶活提高接近一倍。不同的培养基装液量对白腐菌F．velutipes合成漆酶也有影响，300mL三角瓶中装80mL液体培养基，较为经济合算。在液体静置培养条件下，也分别考察了不同氮源、碳源和微量元素对白腐菌F．velutipes合成漆酶的影响。微量的Cu2+促进漆酶合成的效果非常明显，当Cu2+浓度为0.5μmol/L时，酶活峰值出现在第16天，为26570IU/L，比对照酶活提高67％。 通过盐析、超滤和DEAE-Sephadex A-25离子交换层析得到毛柄金钱菌漆酶，并对其理化性质进行了研究，结果表明：F．velutipes漆酶最适宜的温度和pH分别是60℃，pH4.0。其在35～70℃，pH4.0～4.5表现出较强的稳定性。F．velutipes漆酶氧化ABTS的Km值为1.58×10-4mmol/L。乙醇、丙酮和二氧六环作为溶剂对F．velutipes漆酶的酶活有很强的抑制作用。溶剂浓度越大，F．velutipes漆酶的酶活越低。Zn2+和Cu2+对F．velutipes漆酶有活化作用，而Fe2+、Fe3+对漆酶的抑制作用相当明显。 由F． velutipes漆酶与HBT组成的漆酶/介体系统(LMS)在氧气存在条件下处理KP竹浆适宜的条件为：漆酶用量5.0IU/g浆，pH值为3.0～4.5，反应温度为60℃，酶处理时间为150min。应用F． velutipes漆酶和另两种漆酶分别漂白硫酸盐竹浆，结果发现：与传统的CEH漂白相比，硫酸盐竹浆进行包括漆酶/介体系统处理的OLQP漂白，在达到相近白度情况下，三种不同漆酶在HBT存在下的TCF漂白浆比CEH漂白浆粘度高43.3％～56.2％，并且保持了更好的纸浆强度；F． velutipes产生的漆酶在3种漆酶中漂白效果最好，经OLQP漂白后，竹浆的白度可达80.7％ISO，粘度在800mL/g以上。在没有外加介体的情况下，F． velutipes漆酶处理纸浆仍具有较好的脱木素效果，经OL0QP(L0，无外加介体)漂白后，纸浆白度可达76.7％ISO，比OQP漂后的浆白度提高了23.2％ISO。同时以苄甲基木素模型物藜芦醇为例，结合商品漆酶考察了F． velutipes漆酶催化氧化黎芦醇的反应转化速率。 在介体HBT存在的条件下，含漆酶处理的TCF漂白竹浆白度可达到83.1％ISO，经ECF漂白后纸浆白度可达85.8％ISO，同时纸浆的强度也有不同程度的提高。与经TCF漂白后的纸浆相比，经ECF漂白的纸浆的耐破指数和裂断长都略低，但是白度明显高于前者。实验同时发现在提高纸浆性质方面，漆酶/介体体系置于氧脱木素或者D段之后进行协助漂白比漆酶漂段置于氧脱木素之前作为预漂剂更有效。 应用F． velutipes漆酶/HBT漂白高卡伯值马尾松KP浆的结果表明，该漆酶是一种漂白能力强、脱木质素选择性好的高效漆酶；在漂白纸浆的同时，该漆酶可以有效改善纸张的强度。 经过F．velutipes漆酶漂白后，马尾松KP纤维粗度下降，而卷曲指数和扭结指数有上升的趋势，表明纤维的挠曲性得到改善，对提高纤维间的结合力更加有利。借助X射线衍射仪测定纸浆纤维结晶度的结果表明，经过漆酶处理后，马尾松KP浆纤维的结晶度均较未经酶处理的对照浆高，这是由于在漂白过程中，浆中的木素及部分半纤维素等无定形物质溶出的缘故。其中强度性质最好的OLQP漂后浆的结晶度也最高。 利用气相色谱在分离和检测不同类型的气体，必须选取不同的色谱柱。因此，为了满足多任务气相色谱的分析，只能频繁地更换色谱柱，而每次更换柱子，都有可能造成柱子的毁坏和耗损，并且重复进行老化、稳定等过程。利用改进的顶空—气质连用(HS—GC/MS)方法，利用质谱选择性检测器定量检测CO2，从而测定纸浆中的羧基含量，无需购买特定的气相色谱柱分离这类无机气体，方便易行。新的测定方法灵敏度高，定性定量效果令人满意。利用改进的方法测定马尾松KP浆中的羧基含量发现，无论是漆酶单独处理还是漆酶/HBT处理，都能使浆中的羧基含量增加，原因可能是漆酶漂白除去部分木素后，暴露出更多的表面积，有利于氧化反应的进行和羧基的生成，使得羧基含量增加所致。 利用原子力显微镜(AFM)对漆酶漂白前后马尾松KP纤维表面的分析主要得到了两方面的信息：漆酶处理前后对木素含量和分布的影响以及对纸浆纤维表面形貌的改变。结果表明，经KP法制浆后，纸浆纤维细胞壁上富含木素和抽出物的胞间层和初生壁基本溶出，证实裸露在KP纤维表面上的主要是S1层。漆酶漂白除去了纸浆纤维表面大部分的木素和抽出物，使得S1层上的微细纤维取向更加清晰。同时，漆酶漂白后马尾松KP浆纤维的相差值也明显下降，这也是漆酶漂白去除纤维表面的木素和抽出物等疏水性物质的结果。通过比较漆酶漂白前后马尾松KP浆纤维的AFM地形图，也证实了上述结论。利用针尖修饰有-OH的AFM探针接触来模拟纸浆纤维之间的作用，发现经过漆酶漂白后，纸浆的平均粘附力提高，即纸浆表面能量增大。这说明纸浆表面可以和针尖上的-OH形成氢键的-OH和-COOH等基团的数量也随之增加了。 利用X射线光电子能谱(XPS)对各种漂白浆纤维表面的氧碳比(O/C)和C1s峰的碳价态比的分析结果表明，经过漆酶处理后，纸浆纤维表面的氧碳比(O/C)上升，同时，纤维表面C1峰下降，漆酶处理使纤维表面暴露出了更多的亲水性基团，碳水化合物的含量提高，木素含量减少，有利于促进抄纸时纤维间氢键结合的形成。同时XPS分析为AFM直接观察到的纸浆纤维表面微观结构的变化提供了有利的佐证，进一步明确了漆酶漂白马尾松KP浆的同时提高纸浆强度的机理。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1生物技术在制浆造纸工业中的应用

1.1.1生物制浆

1.1.2生物漂白

1.1.3生物技术在树脂控制中的应用

1.1.4生物脱墨

1.1.5生物技术处理制浆工业废水

1.2漆酶

1.2.1漆酶分子催化活性中心的结构与功能

1.2.2漆酶的结构特征

1.2.3漆酶的催化机制

1.2.4漆酶在制浆造纸工业中的应用

1.2.5漆酶降解木素的机理

1.2.6小分子介体

1.2.7漆酶/介体体系(LMS)漂白纸浆的工艺条件

1.3白腐菌产漆酶的研究进展

1.3.1菌种

1.3.2培养条件

1.3.3碳源和氮源

1.3.4添加剂

1.3.5漆酶活性的影响因素

1.3.6白腐菌漆酶对木素的降解作用

1.4 TCF和ECF漂白的应用现状和前景

1.4.1无元素氯漂白(ECF)

1.4.2全无氯漂白(TCF)

1.5顶空技术在制浆造纸工业中的应用

1.5.1顶空分析基本原理

1.5.2定量分析

1.5.3气液平衡常数的测定

1.6纤维的表面性能及表面分析技术

1.6.1电子显微镜分析

1.6.2原子力显微镜

1.6.3激光共聚焦扫描显微镜

1.6.4 X射线光电子能谱(XPS)

1.6.5二次离子质谱

1.6.6接触角

1.6.7红外反射--吸收光谱

1.7本论文的研究目的、意义和主要内容

1.7.1研究目的和意义

1.7.2主要研究内容

第二章白腐菌F.velutipes合成漆酶的研究

2.1实验原材料与方法

2.1.1菌种

2.1.2土豆汁的制备

2.1.3斜面接种

2.1.4平板接种

2.1.5菌丝悬浮液的制备

2.1.6培养基

2.1.7接种

2.1.8培养条件

2.1.9酶液的制备

2.1.10酶活的测定

2.1.11固体发酵过程中白腐菌F.velutipes对稻草木质素降解的研究

2.1.12裂解-气质联用分析F.velutipes处理后稻草化学成分的变化

2.2结果与讨论

2.2.1固体培养条件下，F.velutipes的木质素降解酶系统

2.2.2固体发酵对F.velutipes合成漆酶的影响

2.2.3 F.velutipes对稻草的生物处理

2.2.4 F.velutipes液体培养条件下，纤维素酶和半纤维素酶的产生

2.2.5 F.velutipes液体培养条件下，木质素降解酶的产生

2.2.6液体培养方式对漆酶合成的影响

2.2.7液体振荡培养对F.velutipes合成漆酶的影响

2.2.8液体静置培养对F.velutipes合成漆酶的影响

2.3本章小结

第三章白腐菌F.velutipes漆酶的分离纯化及特性研究

3.1实验原材料与方法

3.1.1实验材料与仪器

3.1.2实验方法

3.2结果与讨论

3.2.1漆酶的分离纯化

3.2.2漆酶的理化性质分析

3.3本章小结

第四章漆酶用于硫酸盐浆TCF漂白的研究

4.1实验原材料与方法

4.1.1原料

4.1.2漆酶的制备及酶活测定

4.1.3漆酶用于KP竹浆TCF漂白的研究

4.1.4利用含LMS的TCF和ECF漂白改善竹浆性质的研究

4.1.5漆酶用于高卡伯值马尾松KP浆TCF漂白的研究

4.1.6打浆

4.1.7纸浆的物理性能的测定

4.1.8漆酶介体处理后残液中剩余酶活力的计算

4.2结果和讨论

4.2.1漆酶用于KP竹浆TCF漂白的研究

4.2.2含LMS的TCF和ECF漂白改善竹浆性质的研究

4.2.3高卡伯值马尾松KP浆的漆酶漂白

4.3本章小结

第五章漆酶漂白马尾松硫酸盐浆纤维特性的分析

5.1实验原材料与方法

5.1.1实验原材料

5.1.2实验方法

5.2结果与讨论

5.2.1马尾松KP浆经F.velutipes漂白前后纤维质量分析(FQA)

5.2.2 X射线衍射仪测定纸浆结晶度

5.2.3顶空—气相色谱法(HS-GC)测定纸浆中的羧基含量

5.2.4顶空—气质联用色谱法(HS-GC/MS)测定纸浆中的羧基含量

5.3本章小结

第六章白腐菌F.velutipes漆酶漂白前后纸浆纤维的表面形貌分析

6.1实验原材料与方法

6.1.1实验原材料

6.1.2原子力显微镜(AFM)观察

6.2结果与讨论

6.2.1利用AFM表征KP浆纤维表面的化学组成

6.2.2利用AFM分析漂白马尾松KP浆纤维表面地形(Topography)

6.2.3利用AFM分析漂白浆与针尖之间的粘附力

6.3本章小结

第七章白腐菌F.velutipes漆酶漂白前后纸浆表面化学和纤维特性分析

7.1实验原材料与方法

7.1.1实验原材料

7.1.2 X-射线光电子能谱(XPS)分析

7.2结果与讨论

7.2.1漆酶处理前后纸浆表面氧碳比(O/C)的变化情况

7.2.2漆酶处理对纸浆表面碳价态的影响

7.3本章小结

结论

本论文的创新之处

对未来工作的建议

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢