一种生产漆酶的白腐粗毛革孔菌诱变菌T906及其制备方法

摘要

本发明公开了一种生产漆酶的白腐粗毛革孔菌诱变菌T906及其制备方法。本发明所述诱变菌T906（CoriolopsisgallicaT906）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2011317，保藏日期为2011年9月15日，保藏地点为中国武汉武汉大学。该诱变菌株是以购自中国林业微生物菌种保藏管理中心的野生粗毛革孔菌（保藏号：cfcc88387）为出发菌株，通过紫外线和亚硝基胍联合诱变筛选得到的。在优化条件下该诱变菌的漆酶产量达到213U/mL，菌体形态和培养特征与出发菌有明显区别，且连续传代30次以上不退化，具有遗传稳定性。

说明书

技术领域

    本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种生产漆酶的白腐粗毛革孔菌诱变菌T906及其制备方法。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其作用底物广泛，能够有效降解木质素及催化氧化多种酚和芳胺类化合物，在生物能源、环境保护、造纸工业、食品工业、生物检测等领域均具有广阔的应用前景和潜在应用价值。大部分能够引起木本或草本植物腐化的真菌均能产生漆酶。

其中，白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌的统称，具有突出的木质素降解能力，主要为担子菌，少部分为子囊菌，包括革盖菌属（Coriolus）、卧孔菌属（Poria）、多孔菌属（Polyporus）、原毛平革菌属（Phanerochaete）、侧耳属（Pleurotus）、烟管菌属（Bjerkandera）和栓菌属（Tramete）等。但野生白腐真菌的漆酶生产能力普遍低下，远远满足不了漆酶的工业化生产和应用，使得漆酶应用方面的研究仍然停留在实验室阶段。

粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）是一种降解木质纤维素能力强、产生木质纤维素降解酶酶系齐全的白腐担子菌，在我国广泛分布，主要生长于杨树上，是杨木的一种主要生物降解者，它是目前已知产生漆酶能力最强的野生菌株之一。其降解能力比木质素降解模式菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）更强。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能大量产生漆酶的白腐粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）诱变菌T906（保藏号：CCTCC M 2011317），为一种新的菌株，与出发菌株的菌体形态和培养特征存在明显区别，且连续传代30次以上不退化，具有遗传稳定性，在优化条件下酶活力可达213 U/mL。

本发明还提供了该诱变株的培育方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种生产漆酶的白腐粗毛革孔菌诱变菌T906（Coriolopsis gallica T906），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2011317，保藏日期为2011年9月15日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；

    该诱变菌的菌体形态：平板培养为白色或乳白色丝状真菌，极少或不产生孢子；显微特征与野生粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）相比，菌丝体较短，菌丝交缠较密；培养特征：摇瓶培养不易生成菌球，30℃摇瓶培养6~20天，发酵液呈土黄色，且颜色随时间逐渐变深。

本发明提供的一株大量生产漆酶的白腐粗毛革孔菌T906，是以购自中国林业微生物菌种保藏管理中心的野生粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）（保藏号：cfcc 88387）为出发菌株，通过紫外线和亚硝基胍联合诱变筛选所得。诱变菌T906用PDA液体培养基培养，漆酶活力比野生菌高10多倍，在优化培养条件下最高漆酶酶活可达213 U/mL，且诱变菌T906高产漆酶的性状能够稳定遗传，连续继代30余次未见退化现象，具有良好的产业化应用前景及重要的研究价值。

本发明生产漆酶的白腐粗毛革孔菌T906的诱变方法为：

    （1）野生粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）于PDA液体培养基中培养2~6天待菌丝体形成，加入无菌玻璃球，振荡培养直菌丝体磨碎，1~4层无菌纸巾过滤菌丝体，收集滤液；

（2）将滤液转移至无盖无菌培养皿中，加入无菌磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上低速搅拌；

（3）将（2）所述的搅拌装置放在距离紫外灯20 cm~30 cm处，照射10~90秒钟；

（4）取（3）所述的经紫外照射的菌液，用浸泡于1~10 ng/mL亚硝基胍的涂布棒涂布PDA-RB亮蓝平板或PDA-愈创木酚平板；

（5）另外取未经紫外照射的菌液，用未经亚硝基胍溶液浸泡的涂布棒涂布PDA-RB亮蓝平板或PDA-愈创木酚平板，作为对照；

（6）将（4）和（5）所述平板置30℃培养箱避光培养至有菌体长出，挑取生长变化大或平板变色圈大的诱变菌，平板继代培养后摇瓶培养并测定漆酶活力。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）所获得的白腐粗毛革孔菌诱变菌T906漆酶产量高，遗传稳定，具有良好的应用前景及重要的研究价值。

（2）采用紫外线和亚硝基胍联合诱变的方法，弥补了单纯使用紫外线诱变容易产生回复突变的缺点，使诱变菌优良特征的遗传更稳定。

（3）亚硝基胍诱变的步骤与涂布平板的步骤相结合，简化了紫外线和亚硝基胍联合诱变的操作过程。

（4）使用超低浓度的亚硝基胍溶液浸泡涂布棒，使操作过程更安全，并且避免亚硝基胍对其他设备用品等的污染。

具体实施方式

    以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例：

1. 把从我国北方杨树上筛选出的野生粗毛革孔菌（Coriolopsis gallica）接种于PDA试管斜面，30℃培养5天， 4℃保存。

2. 把试管斜面保存的野生粗毛革孔菌转接PDA平板，30℃培养箱倒置培养7天，用直径0.6 cm的打孔器取3个菌片，放入PDA液体培养基培养3天，

3. 无菌操作下加入灭菌玻璃珠，覆盖满摇瓶底部，200rpm培养3小时。

4. 用3层灭菌纸巾过滤菌丝体，收集滤液，并将滤液转移至无盖灭菌培养皿中，加入灭菌磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上低速搅拌，于暗室中，离紫外光25cm照射30或40秒钟。

5. 收集经紫外照射后的菌液，用浸泡于3~6 ng/mL亚硝基胍的涂布棒涂布PDA-RB亮蓝平板或PDA-愈创木酚平板，置30℃培养箱避光培养1~2周。

6. 以未经紫外照射的菌液，用清洁涂布棒涂布PDA-RB亮蓝平板或PDA-愈创木酚平板，作为对照。

7. 挑取菌体生长变化大或平板变色圈大的诱变菌，于PDA-RB亮蓝平板或PDA-愈创木酚平板继代培养7天。

8. 选取在继代平板上变色圈大的诱变菌，用直径0.6 cm的打孔器取3个菌片，接种于发酵培养基，150rpm，30℃摇床培养，以野生粗毛革孔菌为对照。从第三天起每隔1天取发酵液，离心，上清液用ABTS为底物测定漆酶活力，选取漆酶活力大于野生粗毛革孔菌的诱变菌，PDA试管斜面保存待用（表1）。

表1 野生粗毛革孔菌与诱变粗毛革孔菌T906发酵结果比较