叶下珠复方抗HBV、人肝癌裸鼠移植瘤及其分子生物学机制探讨

摘要

一、研究目的体外观察叶下珠复方抗HBV及抑制HBsAg、HBeAg分泌的作用，在动物体内观察叶下珠复方对免疫性肝损伤的保护作用，并初步揭示其护肝机制；研究叶下珠复方的体内和体外抗肿瘤活性，并探讨其抗肿瘤的分子生物学机制。 二、实验步骤1.观察叶下珠复方体外抗HBV的作用2.叶下珠复方抗ConA所致的免疫性肝损伤3.叶下珠复方对人肝癌HePG2细胞体外增殖的抑制作用4.建立人肝癌HePG2裸鼠移植瘤模型5.叶下珠复方的体内抗肿瘤作用6.用RT-PCR、分子克隆、基因序列测定和免疫组化等方法观察叶下珠复方对移植瘤裸鼠p53、c-myc基因表达的调节作用。 三、实验方法1.以2.2.15细胞为模型，根据MTT法检测叶下珠复方的细胞毒性。用公式求算出药物的最大无毒浓度及半效致死量TC50。将2.2.15细胞按1×105/ml接种24孔细胞培养板，每孔1.2ml，次日弃培养液。以不同药物对2.2.15细胞的最大无毒剂量为起始浓度，加入培养液稀释(系列2倍稀释)的不同浓度的不同药物，每浓度6孔，每3天换含药物的培养液一次，同时设不加药物对照。收集每次换液的培养上清250ul，-20℃冻存，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，并计算药物对抗原的抑制率、半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)，判断药物效果，用荧光定量PCR测定HVB-DNA。 2.NIH小鼠48只随机分为6组，每组8只，分别为空白对照组，模型对照组，叶下珠复方大、中、小剂量组(40g/kg、20g/kg、10g/kg)，联苯双酯(150mg/kg)治疗组，除空白对照组外，其余小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA20mg/kg，4h后各组开始灌胃给药，空白对照组和模型对照组均灌等量生理盐水，次日晨开始第二次给药，第三天给药后4h第二次尾静脉注射ConA20mg/kg，8h后取摘眼球取血，赖氏法检测ALT、AST，ELISA法检测TNF-α和IL-8含量。肝脏取出后取左叶中性甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜观察病理切片并拍照。 3.取对数生长期的HePG2细胞消化、计数，以2.5×104/孔种植于96孔板中，培养24小时后，加入不同浓度的叶下珠复方50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml分别培养24h、48h和72h，对照组加入等体积培养液，每浓度组每时间段设6个平行孔。根据MTT法检测叶下珠复方的半数有效浓度和各浓度的细胞增殖抑制率，用流式细胞仪分析细胞周期和各药物处理组不同时间段的凋亡率，透射电镜观察叶下珠复方对HePG2细胞超微结构的影响。制作细胞爬片，叶下珠复方处理后用Hoect33258荧光染色，荧光显微镜观察细胞凋亡率。 4.将人肝癌HePG2细胞培养至对数生长期，用含0.02％EDTA的0.125％胰酶消化，PBS洗涤细胞两次，1000rpm离心3min，生理盐水调整细胞悬液浓度至1×108/ml，每只裸鼠项肩部皮下注射0.2ml。接种细胞第二天后，将裸鼠随机分为3组，分别是叶下珠复方治疗组，生理盐水组(阴性对照)，5-Fu组(阳性对照组)。治疗组每天用叶下珠复方灌胃10g/kg，阴性对照组每天口服同体积生理盐水，5-Fu组(阳性对照组)，腹腔注射5-Fu20mg/kg.d，每周给药二次。观察裸鼠成瘤情况和精神、饮食、活动、大小便等一般情况，每周用游标卡尺测量瘤体最大长度(a)、宽度(b)和高度(c)，根据公式V=ab2/2，计算肿瘤体积，并画出肿瘤体积时间生长曲线。给药35天后经裸鼠眼眶静脉丛取血后处死裸鼠(分离血清-20℃冻存备用)，剥离瘤组织，并称瘤重，迅速置于液氮罐中冻存。放免法检测各组裸鼠血清中外周血甲胎球蛋白(AFP)含量，瘤体经10％中性福尔马林固定，石蜡切片，HE常规染色，光镜下观察、拍照，观察其病理组织学改变。 5.将各组裸鼠瘤组织的RNA提取后逆转录，RT-PCR扩增p53和C-myc基因。应用NIHimage1.60软件分析不同实验组p53和C-mycPCR产物的电泳条带，对扩增产物进行半定量分析。将表达的p53基因与pTARGETTM载体的连接，转化入JM109感受态菌中，筛选阳性克隆提取细菌质粒进行酶切鉴定，菌液送英骏广州测序公司测序。裸鼠瘤组织以石蜡包埋制成4um厚的切片，以SP法检测p53蛋白和C-myc蛋白表达。 四、结果1.在半数毒性浓度下，叶下珠复方浓度为250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.25ug/ml、15.6ug/ml时对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率分别为54.8％、43.6％、37.4％、26.7％、14.6％，其TI值为6.1；对HBeAg的抑制率分别为78.6％、72.9％、67.1％、56.8％、51.5％，其TI值为24.6。不同浓度的叶下珠复方对2.2.15细胞分泌的HBV-DNA抑制率不同，随着药物浓度的增加，HBV-DNA定量逐渐降低。但在1000ug/ml时由于药物的毒性作用所致细胞死亡，大量病毒由细胞释出，HBV-DNA绝对量反而增加。 2.在血清生化检查的结果中，模型组ALT、AST及TNF-α、IL-8水平明显高于空白对照组，其差异有显著性意义(p＜0.01)，说明造模成功。叶下珠复方各剂量组ALT、AST及TNF-α、IL-8活性均低于模型组，其差异有显著性意义(p＜0.01)，说明叶下珠复方各剂量组均对ALT、AST及TNF-α、IL-8有显著降低作用。叶下珠复方各剂量组ALT、AST与联苯双酯组比较无显著意义(p＞0.05)，但叶下珠复方各剂量组TNF-α水平与联苯双酯组比较有显著性意义(p＜0.05)，说明叶下珠复方各剂量组对TNF-α的降低效果优于联苯双酯组，联苯双酯组对TNF-α无降低作用。在叶下珠复方各剂量组之间比较，大、中剂量组与小剂量组之间有显著性差异(p＜0.05)，大剂量和中剂量组优于小剂量组。肝组织病理切片显示，空白组小鼠肝小叶排列整齐，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦未见异常。模型组肝细胞浊胀、轻度脂肪变性，有的呈气球样变，可见明显点状坏死及大片灶状坏死，坏死灶周围可见大量炎性细胞浸润，Kupffer细胞增加。联苯双酯组病变较轻，但该组仍有少量标本小叶结构明显破坏，各标本均有小灶性坏死和肝细胞浊肿，Kupffer细胞轻度增加，少数血管出现轻度浸润；叶下珠复方小剂量组与联苯双酯组相当，小部分标本仍可见大面积灶性坏死，各标本均有小灶性坏死、肝细胞浊肿、轻度脂肪变性，大部分血管出现极轻度围管浸润，Kupffer细胞轻度增加；叶下珠复方中剂量组未见大面积灶性坏死，各标本仍见肝细胞浊肿，轻度脂肪变性，小部分血管出现极轻度围管浸润，可见小面积局灶性坏死，Kupffer细胞轻度增加；叶下珠复方大剂量组肝细胞排列整齐，部分肝组织可见散在点状坏死和灶性坏死，肝细胞损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润显著减少。少数血管出现极轻度围管浸润，轻度灶性坏死，余未见异常。 5.肿瘤生长曲线显示对照组肿瘤呈递增性生长，而叶下珠复方治疗组和5-Fu组生长曲线则较为低平，肿瘤生长明显受到抑制。叶下珠复方治疗组抑瘤率为32.5％，5-Fu组为30.8％，均与对照组有明显差异(p＜0.05)。裸鼠移植瘤组织的病理学观察，瘤组织间有较多粗细不一的纤维组织将瘤细胞分隔成巢状，部分癌细胞呈梁状，腺腔状排列，可见较多发育不完整的血窦结构，大多数细胞呈三角形，胞浆丰富，较多嗜酸性颗粒，胞核大小形态极不规则，核浆比例增大，可见较多病理性核分裂象，瘤巨细胞偶见。叶下珠复方治疗组瘤块中癌细胞排列散乱，有大量核固缩或碎裂的表现为凋亡状态的细胞和不同程度坏死；5-Fu组瘤块内有片状坏死，但细胞排列较为整齐。 6.叶下珠复方治疗组有p53基因表达，生理盐水及5-Fu组均未见p53明显表达。对该表达的p53基因进行克隆和序列测定，证实该表达的p53基因为野生型。三组均有不同程度的c-myc基因表达，以β-acting为内参照，分别对各组所出现的特异性扩增条带进行半定量分析，结果显示：叶下珠复方治疗组c-myc表达量明显低于生理盐水及5-Fu组(p＜0.05)。各组未见p53蛋白表达，进一步说明叶下珠复方组表达的为野生型p53基因。三组均有C-myc蛋白胞浆阳性表达，叶下珠复方治疗组、5-FU组c-myc蛋白表达均较阴性对照组低(P＜0.01)，但叶下珠复方治疗组和5-FU组c-myc蛋白表达组间无明显差异(p＞0.05)。 五、结论1.叶下珠复方有体外抗HBV作用。 2.叶下珠复方对Con-A所致的免疫性肝损伤有保护作用，其机制与降低TNF-α和IL-8等介导肝损伤的细胞因子分泌有关。 3.叶下珠复方对人肝癌HePG2细胞的体外增殖有抑制作用，阻滞细胞周期，诱导肝癌细胞凋亡可能是其机制之一。 4.叶下珠复方有体内抗肿瘤活性，对人肝癌裸鼠移植瘤的生长有抑制作用，促进野生型p53基因的表达和下调c-myc基因表达是其抗肿瘤的分子生物学机制之一。

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一章文献研究

第二章实验研究

全文结论及本课题创新点

第三章结语

参考文献

附录

致谢