疏肝健脾补肾方对CHB患者、HBV转基因小鼠的免疫调节作用研究

摘要

1 研究设想: 乙肝慢性化机制与T淋巴细胞亚群的低反应性、NK 活性降低、Th1 类细胞因子水平下降等免疫功能不全、体内高滴度病毒含量及对感染细胞的免疫耐受状态有关。目前尚未发现根除HBV的药物，尚未明确HBV免疫耐受发生在哪一个应答环节或关键步骤上。中药复方对慢性乙型肝炎机体免疫功能表现出良好的调节作用，并能有效地促进HBV的清除。从CHB病毒水平与机体免疫状态二者的相关性入手，运用中药复方 (疏肝健脾补肾方)对CHB患者、HBV转基因小鼠进行抗病毒和免疫调节作用研究目前尚未见报道。 2 研究目的: 本课题观察疏肝健脾补肾方联合ADV治疗CHB患者前后病毒DNA水平与免疫功能的相关性，进行抗病毒、免疫调节和中西医结合疗效研究，为防治CHB提供新思路和实验依据。以体外细胞模型来探讨中药抑制HBV复制的机理和意义。并在以往研究基础上观察疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠的抗病毒和免疫调节作用，探讨中医药治疗HBV的疗效及作用机制。 3 研究方法: 3.1 疏肝健脾补肾方对慢性乙型肝炎患者的免疫学调节机制51例肝郁脾虚兼脾肾阳虚型CHB患者按随机数字分成A、B、C三组。A 为疏肝健脾补肾方组；B 为疏肝健脾补肾方+ADV组；C为ADV对照组，每组各17例。A组患者在对症护肝的基础上，服用疏肝健脾补肾方，6个月为1用药疗程；B组患者在对症护肝的基础上，服用疏肝健脾补肾方和 ADV；C 组患者在对症护肝的基础上，服用 ADV。治疗前、治疗后6个月均检测肝功能、免疫功能和病毒学指标。观察CHB患者的临床症状和体征：在自动生化仪上用常规的生化方法检测血清 ALT、AST、STB、A/G 等指标；采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA，乙肝两对半ELASA法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBe：流式细胞仪免疫荧光法检测外周血T淋巴细胞亚群百分率、自然杀伤细胞：放免法检测血清IL-2。 3.2 疏肝健脾补肾方体外抗乙肝病毒的实验用2.2.15 细胞作为体外模型，将疏肝健脾补肾方药物原液倍比稀释成7个浓度上药，同时设无药物细胞组进行对照。上药8天后收集上清用ELISA法测定 HBsAg、HBeAg。MTT 法检测药物细胞毒性，并计算药物对抗原的半数抑制浓度(IC<,50>)及治疗指数(TI)。 3.3 疏肝健脾补肾方对小鼠的急性毒性实验实验前把BALB/C 小鼠随机分为6组，疏肝健脾补肾方 160g/kg/d组、80g/kg/d组、40g/kg/d组、20g/kg/d组、10g/kg/d组和正常对照组(等量生理盐水)，每组10只。以确定不同浓度的疏肝健脾补肾方安全剂量范围。动物禁食16h后一次性灌胃给予受试药物，观察5d，逐日记录中毒症状、死亡情况，死亡动物应及时尸解，记录病变情况，肉眼观察其病变组织。给药后同时观察动物死亡数、耸毛、蜷卧、耳廓苍白或充血、突眼、步履蹒跚、大小便、瘫痪、昏迷、抽搐、步态、呼吸困难等情况。最后断头处死所有动物。 3.4 疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理的干预作用实验动物共分为6组。正常对照组为6-8周龄非HBV转基因雄性 BALB/C 小鼠10只，灌以等量灭菌等渗生理盐水；SPF级 HBV 转基因雄性小鼠50只，HbsAg 均为阳性，随机分为以下5组：模型组 (灌以等量灭菌等渗生理盐水)、疏肝健脾补肾方低剂量组(按10g克生药/kg体重/天灌胃)、疏肝健脾补肾方中剂量组 (按20g克生药/kg体重/天灌胃)、疏肝健脾补肾方高剂量组 (按40g克生药/kg体重/天灌胃)、ADV组 (按50mg/kg体重/天灌胃ADV)，每组10只。每天按时喂药，连续21d。采血前禁食12h，最后1次采血后处死动物。分别于给药前1天(TO)、给药第10天(T10)、给药第21天(T21)、停药后3天(P3)取血，离心取血清，-80℃冻存，用ELASA法检测血清HBsAg，荧光定量PCR法测定血清中HBV DNA。取脾，按常规制备脾单细胞悬液，上流式细胞仪用荧光标记抗体法测定脾T淋巴细胞亚群，用放免法测定脾培养上清中的IL-2、ELISA 法测定脾培养上清中的IFN<,γ>。取病变明显处的肝脏作病理学切片及HbcAg免疫组化。 4 研究结果: 4.1 疏肝健脾补肾方对慢性乙型肝炎患者的免疫学调节机制B组在胁肋胀痛、腹胀便溏、畏寒肢冷、抑郁烦闷、身倦乏力、少腹腰膝冷痛等症状改善方面，优于其它二组。临床疗效方面，三组总有效率之间比较差异均无显著性意义。三组在ALT、AST、TSB、A/G等肝功能恢复方面效果均好，其中B组 (疏肝健脾补肾方+ADV)ALT复常率高于单一中药、西药组。三组HBV DNA转阴率总体比较差异有显著性意义，以B组(疏肝健脾补肾方+ADV)转阴率最高。A组、B组、C组治疗前后HBV DNA 含量差异有显著性意义，尤以B组为甚。上述结果提示，中西医联合用药比单一中药和单一西药抑制病毒复制的效果更好。三种治法均可增加CD3<'+>、CD4<'+>百分比，减少CD8<'+>细胞百分比，尤以A组、B组增加CD3<'+>细胞、A组增加CD4<'+>细胞、B组减少CD8<'+>细胞的效果更为显著。而ADV单用时增加CD3<'+>、CD4<'+>和减少CD8<'+>的作用则较弱。B组可同时非常显著性提高NK细胞活性和IL-2分泌：C组仅对NK细胞有正向激活作用，对IL-2则无显著影响；相反，A组对NK细胞活性影响不显著，对IL-2水平则有显著提升作用。B组治疗前后CD3<'+>百分比的增加、NK细胞的增加、CD8<'+>百分比的减少与HBV DNA 载量的减少呈显著正相关。A组治疗前后CD4<'+>百分比的增加与HBV DNA载量减少呈显著正相关。B组、C组患者各1例偶见药物不良反应。 4.2疏肝健脾补肾方体外抗乙肝病毒的实验疏肝健脾补肾方对2.2.15 细胞的半数毒性浓度TC<,50>为30.28mg/ml，对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg半数抑制浓度为25.96 mg/ml、36.46 mg/ml，治疗指数分别为1.17、0.83。说明疏肝健脾补肾方能低效抑制细胞表达 HBsAg，且有毒性作用，而无抑制HBeAg抗原的作用。 4.3 疏肝健脾补肾方对小鼠的急性毒性实验疏肝健脾补肾方160g/kg/d组显示出一定的不良反应。从第2天开始均表现出纳差、饮水量少、乏力、行动迟缓、蜷卧、大便溏泄等情况。在第4天死亡1只，在第5天死亡2只。经解剖发现肝脏呈暗红色，胃肠肿胀并扭曲。可能由于药物的浓度太大，引起小鼠肝脏水肿、出血、坏死所致。而疏肝健脾补肾方80g/kg/d组、40g/kg/d组、20g/kg/d组、10g/kg/d组给药后动物一般状况良好，未发现明显的毒性反应，未见动物死亡。因此，本课题实验所用剂量均在80g/kg/d以下范围进行。 4.4 疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理的干预作用疏肝健脾补肾方中、大剂量及ADV组HBV Tg鼠血清HBsAg转阴率分别在给药后第10天、第21天、停药后第3天进行比较，差异均无显著性意义。ADV具有较好的减少HBV Tg 鼠血清HBV DNA 载量的作用，但停药后3天有反跳。疏肝健脾补肾方大、中剂量组均具有降低HBV Tg血清 HBV DNA 载量的作用，尤其以大剂量效果明显，虽然没有减少到ADV组的水平，但治疗前后差异有显著性意义，且停药后无明显反跳，说明中药作用持久、平稳。模型组Tg鼠肝脏病理改变类似临床轻度肝炎表现，随着中药疏肝健脾补肾方浓度的增大，炎症得以缓解，大剂量组的肝板排列整齐，淋巴细胞浸润程度减轻。而ADV治疗小鼠肝组织汇管内见散在的淋巴细胞浸润，无纤维组织增生，但中央静脉周围肝细胞轻度脂肪变性。疏肝健脾补肾方中、大剂量和ADV均能减少肝组织中HbcAg表达，尤其以大剂量明显。疏肝健脾补肾中药能够上调HBV转基因小鼠CD3<'+>、CD4<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>，下调CD8<'+>T细胞比值水平，具有正向T淋巴细胞免疫调节作用，尤其以大剂量组效果更为显著。ADV 也具有提高HBV 转基因小鼠细胞免疫的功能(如CD3<'+>百分比)，但作用相对中药较弱。运用大、中、小剂量疏肝健脾补肾方和ADV 均能提高HBV转基因小鼠血清IL-2、IFN-γ含量，与模型组相比差异有显著性意义。且运用大剂量和中剂量的疏肝健脾补肾方治疗后IL-2、IFN-γ水平已高于正常对照组。疏肝健脾补肾方中剂量组 CD3<'+>、IFN-γ与给药前后 HBV DNA 载量的减少呈显著正相关，疏肝健脾补肾方大剂量组 CD4<'+>、CD8<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>与给药前后HBV DNA 载量减少呈显著正相关。 5 结论: 1、疏肝健脾补肾方是较好的免疫调节剂，能明显地增强Th1 类细胞因子的分泌，使低下的免疫功能得到改善。 2、疏肝健脾补肾方通过对机体免疫功能的调节，进而抑制HBV复制，这符合中医的“扶正”以“祛邪”理论。 3、ADV具有较好的减少体内血清HBV DNA载量的作用，而疏肝健脾补肾方调节机体免疫功能强于ADV。中西医结合用药能明显改善CHB患者临床症状，具有抗病毒、免疫调节等整体功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 文献研究

第一节 慢性乙型肝炎与免疫调节的关系

1T淋巴细胞与慢性乙型肝炎的关系

2细胞因子与慢性乙型肝炎的关系

3MK细胞抑制与清除HBV的机制

4肝细胞在HBV感染与清除过程中的作用探讨

第二节 乙肝病毒转基因鼠模型究进展

1HBV转基因鼠模型的研制

2HBV转基因鼠与免疫耐受

3HBV转基因鼠在抗HBV治疗中的应用

4存在的问题

第三节 慢性乙型肝炎西医学治疗进展

1干扰素治疗CHB临床研究发展

2拉米夫定治疗CHB临床研究发展

3阿德福韦治疗CHB临床研究发展

4恩替卡韦治疗CHB临床研究发展

5不足之处

第四节 中医药防治慢性乙型肝炎研究进展

1病因病机

2辨证分型治疗

3中药抗病毒免疫治疗进展

4疏肝健脾补肾方药调节CHB免疫功能研究进展

5中医药治疗CHB的评价

第五节 研究设想

第二部分 疏肝健脾补肾方对慢性乙型肝炎患者的免疫学调节机制

第一节 资料和方法

1研究对象的总体情况

2入选标准

3排除标准

4分组及一般资料

5三组一般条件的均衡性比较结果

6治疗方法

7研究内容与方法

8疗效评定标准

9统计分析方法

第二节 结果

1三组症状、体征及临床疗效比较

2三组肝功能复常率比较

3三组抗病毒疗效比较

4三组调节免疫功能比较

5三组治疗前后血清HBV DNA与免疫功能的相关性研究

6不良反应

第三节 讨论

1疏肝健脾补肾方对CHB患者临床疗效的影响

2疏肝健脾补肾方对CHB患者肝功能的影响

3疏肝健脾补肾方对CHB患者血清标志物及HBV DNA的影响

4疏肝健脾补肾方对CHB患者免疫功能的影响

5疏肝健脾补肾方对CHB患者血清HBV DNA与T淋巴细胞亚群、细胞因子相关性的影响

第三部分 疏肝健脾补肾方体外抗乙肝病毒的实验

1材料和方法

2结果

3讨论

第四部分 疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理的干预作用

第一节 疏肝健脾补肾方对小鼠的急性毒性实验

1材料和方法

2结果

3讨论

第二节 疏肝健脾补肾方对HBV转基因小鼠免疫病理实验

1材料和方法

2结果

3讨论

第五部分 本研究的创新之处、存在的问题和进一步的研究思路

1本研究的创新之处

2存在的问题

3进一步的研究思路

结语

参考文献

附录

研究生在学期间发表论文情况

致谢