补肾益智方对AD大鼠学习记忆能力及神经生长因子表达的影响

摘要

研究背景：
　　在老年人群中，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）已成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。因缺乏有效的治疗手段，病情不可逆转，较长的病程及高昂的治疗费用，给患者和家属带来巨大的精神痛苦和经济压力，也使国家和社会蒙受沉重的经济负担。迄今为止，AD的病因与发病机制尚未完全明了，治疗药物作用靶点单一，疗效不理想。中药复方因作用于多靶点、多途径，适合早期应用而日益受到关注。
　　补肾益智方是以广州中医药大学赖世隆教授为首的科研小组针对老年性痴呆的主要病理机制、总结长期临床经验并结合现代药理学研究成果设计而成，由蛇床子、枸杞子、人参、制首乌等中药组成。具有填精补髓,益气养血,活血通络,开窍的功效。前期的研究工作表明，该方对于AD具有一定的疗效。
　　研究目的：
　　通过观察补肾益智方对鹅膏蕈氨酸（Ibotenic acid，IBO）致老年性痴呆大鼠模型的学习记忆能力、乙酰胆碱转移酶及神经生长因子表达的影响，探讨补肾益智方防治老年性痴呆的作用机理。
　　方法：
　　按简单随机法把3月龄的SD大鼠72只分为6组:正常组、模型组、石杉碱甲阳性药组和补肾益智方低、中、高剂量组，采用注射IBO损毁Meynert核的方法制造老年性痴呆大鼠模型,造模后正常组和模型组给予生理盐水、阳性药组给予石杉碱甲、补肾益智方低、中、高剂量组给予相应的中药剂量进行灌胃，灌胃28天后，进行为期6日的Morris水迷宫（MWM）行为学测试，水迷宫测试完成后，每组随机取4只大鼠以4％多聚甲醛溶液灌流取脑，石蜡包埋切片,行乙酰胆碱转移酶(Choline Acetyltransferase，ChAT）、神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）免疫组化染色。使用徕卡公司DMR图像分析仪进行拍照分析，测定大鼠海马CA1区CHAT、NGF免疫阳性神经元数目、免疫阳性细胞总面积及平均光密度值。
　　数据结果，包括定位航行实验的游泳时间和游泳路程、空间探索实验的跨平台次数与原平台象限停留时间及大鼠海马CA1区ChAT、NGF免疫阳性神经元数目、免疫阳性总面积及平均光密度值等，均以x±s表示，并用SPSS11.5统计软件对数据进行统计分析。统计分析方法：定位航行测试的数据采用重复测量方差分析对5天数据进行趋势分析；第3-5天单日及3天平均的游泳时间和游泳路程，及空间探索的跨平台次数与原平台象限停留时间数据均采用单因素方差分析；大鼠海马CA1区CHAT、NGF免疫阳性神经元数目、免疫阳性细胞总面积及平均光密度值均采用单因素方差分析。
　　结果：
　　1.MORRIS水迷宫行为学测试结果。
　　1）定位航行试验结果：
　　①五天变化趋势
　　IBO致老年性痴呆大鼠游泳时间及游泳路程均随时间的延长而缩短，呈下降趋势，证明大鼠寻找平台的过程是一个学习并形成记忆的过程。
　　②第3-5天单日及3天平均游泳时间与游泳路程组间比较
　　与正常对照组相比，IBO致老年性痴呆大鼠模型组游泳时间与游泳距离明显延长（P＜0.01），提示造模成功；与模型组相比，阳性对照药石杉碱甲、补肾益智方低、中剂量组能缩短 IBO致老年性痴呆大鼠定位航行游泳时间及游泳距离（P＜0.05,P＜0.01），补肾益智方高剂量组能缩短 IBO致老年性痴呆大鼠游泳时间（P＜0.05）,提示补肾益智方能改善AD模型大鼠的学习能力。
　　2）空间探索试验结果
　　与正常组比较，IBO致老年性痴呆大鼠模型组跨平台次数及第4象限停留时间均明显减少（P＜0.01），提示造模成功。与模型组比较，IBO致老年性痴呆大鼠各治疗组跨平台次数及第4象限停留时间均未见明显差异（P＞0.05）。
　　2.大鼠海马CA1区ChAT免疫组化检测结果
　　与正常对照组相比，模型组 ChAT免疫阳性细胞计数减少（P＜0.01）、阳性细胞平均光密度明显降低（P＜0.01）、阳性细胞总面积明显减少（P＜0.01），即表示ChAT表达减少，说明IBO致痴呆大鼠模型海马中的胆碱能神经元受损。与模型组相比，补肾益智方中、高剂量组、石杉碱甲组的 ChAT免疫阳性细胞数增多（P＜0.01）；补肾益智方低、中剂量组、石杉碱甲组的阳性细胞平均光密度增高（P＜0.01，P＜0.05），高剂量组的阳性细胞总面积明显增大（P＜0.01），说明补肾益智方能促进大鼠海马CA1区ChAT的表达增加。
　　3.大鼠海马CA1区NGF免疫组化检测结果
　　与正常组比较，模型组海马CA1区NGF免疫阳性细胞总面积明显增大（P＜0.01）；阳性细胞数增多，平均光密度增大，但未见统计学意义（P＞0.05），表示IBO致痴呆大鼠模型组海马NGF表达增多，推测其原因是由于胆碱能神经受损，胆碱能神经末梢吸收并逆行传输至基底前脑的NGF减少，因而导致NGF积累在海马区。与模型组比较，石杉碱甲组、低剂量中药组、中剂量中药组阳性细胞总面积均减少（P＜0.05，P＜0.01）；低剂量中药组阳性细胞数减少（P＜0.01），表示补肾益智方减少了IBO致痴呆大鼠海马NGF的表达，推测其原因是因补肾益智方改善了NGF的逆行传输，使被胆碱能神经末梢吸收并逆传至基底前脑的NGF增多，所以减少了积累在海马的NGF。
　　结论
　　补肾益智方低、中、高剂量均能明显改善IBO致老年性痴呆大鼠的学习记忆能力，能促进大鼠海马CA1区ChAT的表达增加，对IBO致痴呆大鼠脑内胆碱能神经元都有一定程度的保护作用；补肾益智方可能具有改善NGF的海马―基底前脑逆行传输的作用。
　　补肾益智方改善AD学习记忆障碍的机制可能为通过增加脑组织ChAT的表达，促进Ach的合成而增加中枢胆碱能系统的神经递质，改善胆碱能神经功能，同时，可能通过改善NGF的逆行运输，增加基底前脑胆碱能神经元中NGF的含量，而对损伤的神经元进行保护和修复。

目录

声明

引言

研究背景

第一节 AD动物模型研究进展

第二节 中医对AD的研究进展

第三节 老年性痴呆的药物治疗进展

研究设想

实验方法与结果

第一节 试验材料与方法

第二节 Morris水迷宫法行为学检测结果

第三节 海马CA1区CHAT免疫组化检测

第四节 海马CA1区NGF免疫组化检测

讨论

1.动物、阳性药及检测指标的选择

2. 实验结果的讨论

结语

1.结论

2.创新点

3.存在问题

4.展望

参考文献

附录

1.技术路线

2.基底前脑注射IBO致痴呆大鼠模型脑组织切片海马CA1区ChAT免疫组化染色图示

3.基底前脑注射IBO致痴呆大鼠模型脑组织切片海马CA1区NGF免疫组化染色图示

4.免疫组化染色S-P法

5.英文缩写表

致谢