RNA结合蛋白HuR和多胺对IEC-6细胞XIAP转录后调节和甘草酸的作用研究

摘要

背景：维护小肠上皮的完整依赖于上皮细胞的增殖，生长和凋亡之间的平衡。凋亡抑制蛋白XIAP(X-link inhibitor of apoptosis protein)在小肠细胞上皮的凋亡中有重要作用，是抑制细胞凋亡的关键蛋白。但RNA结合蛋白HuR能与含AREs（AU rich element）的目的基因的mRNA结合，能稳定目的基因的mRNA，并促进目的基因的翻译，对目的基因进行转录后调节。在对XIAP mRNA的研究中发现，XIAP mRNA具有AREs，可能是HuR的识别片段，HuR可能能通过与XIAP mRNA的AREs结合而对XIAP的表达进行转录后调节。多胺是一类广泛存在于生物体各种组织细胞中的脂肪胺类，对小肠上皮细胞生长、增殖和迁移，修复黏膜、维持黏膜完整有重要作用。多胺耗竭能提高小肠上皮细胞抗凋亡能力，小肠上皮细胞的XIAP表达增高，促进HuR从细胞核内向细胞浆内迁移，细胞浆内的HuR表达增高。但其确却的作用机制仍不明确。甘草的有效单体成分甘草酸具有保护上皮，维护上皮完整的作用，在此前的研究中发现甘草酸能促进一些HuR的目的基因如Bcl-2，p53的表达，但其具体的作用机制不明确。
　　假说：RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达，在多胺耗竭后，HuR从细胞核内向细胞浆内迁移，细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合，稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢，从而导致XIAP表达增高，多胺耗竭是通过增高的HuR对XIAP进行转录后调节，促进XIAP的表达，从而提高小肠上皮细胞的抗凋亡能力,甘草酸亦可能通过此途径对RNA结合蛋白及其目的基因进行转录后调节。
　　本课题的研究，集中在HuR对XIAP表达的转录后调节作用，研究多胺耗竭是否能通过增加HuR在细胞浆中的含量，增加HuR与XIAP mRNA的结合，对XIAP进行转录后调节，从而抗细胞凋亡，明确HuR对XIAP转录后调节作用，多胺耗竭对小肠上皮细胞抗凋亡作用机制。在此同时，将该思路和方法引入中药作用的分子机制研究。将对有保护上皮作用的甘草有效成分甘草酸对RNA结合蛋白的表达及HuR的目的基因表达影响进行研究，以探讨甘草酸是否能通过RNA结合蛋白调节目的基因的表达。
　　通过此研究，明确RNA结合蛋白HuR对XIAP的转录后的调节作用和机制，阐明多胺耗竭通过HuR对XIAP mRNA的转录后调节，并明确其抗细胞凋亡的作用和机制。并将该思路和方法引进中药有效成分的作用机制研究中，初步探讨甘草酸在此途径中的作用。同时为建立中药成分的分子和细胞作用机制研究技术平台提供基础。
　　方法：
　　1. HuR对XIAP转录后调节作用
　　1.1 HuR与XIAP mRNA的相互作用：分别用pull down和mRNP IP分析HuR与XIAP的mRNA的体外和体内结合
　　1.2 HuR过表达对XIAP转录后调节
　　1.2.1 HuR过表达细胞模型：用能表达HuR的腺病毒载体感染大鼠小肠上皮细胞IEC-6过表达HuR，后用western blot检测HuR的表达量。
　　1.2.2 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性的影响：HuR过表达后用actinomycin D终止细胞RNA的合成，在RNA合成终止后的相应时间点提取RNA，用RT-PCR和RT-Q-PCR检测XIAP mRNA的含量。
　　1.2.3 HuR过表达对XIAP mRNA翻译的影响：首先针对Pubmed上的基因库中查出大鼠XIAP的完整基因序列，用带EcoR1和Kpn1酶切位点的引物用 PCR扩增完整的XIAP CR（去除起始密码子atg）和XIAP3’UTR，将PCR扩增产物，pEGFP C1， pEGFP N1进行EcoR1和Kpn1双酶切，后用T4 DNA接酶连接酶切片段和质粒，将 XIAP CR插入 pEGFP N1，置于报告基因 EGFP之前（pEGFP N1-XIAP CR）；将XIAP3’UTR插入pEGFP C1，置于报告基因EGFP之后（pEGFP N1-XIAP3’UTR）。后转化感受态细胞 DH5α，通过卡那霉素抗性筛选挑取阳性克隆，抽提质粒，后进行测序法鉴定。对细胞进行HuR过表达处理，再转染相应的质粒，后观察HuR过表达对质粒报告基因表达的影响，由此观察HuR通过XIAPmRNA对XIAP翻译表达的作用。
　　1.2.4 HuR过表达对XIAP表达的影响：HuR过表达后，用western blot检测XIAP表达量。
　　1.3 HuR沉默对XIAP转录后调节
　　1.3.1 HuR表达沉默的细胞模型：用siHuR转染IEC-6，建立HuR沉默的细胞模型；
　　1.3.2 HuR表达沉默对XIAP转录后调节：HuR沉默后，如前检测XIAPmRNA的稳定性和XIAP的表达；转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP3’UTR，观察HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。
　　2．多胺对XIAP转录后调节
　　2.1多胺耗竭细胞模型建立：用多胺合成关键酶ODC（鸟氨酸脱羧酶）的抑制剂DFMO建立多胺耗竭模型。
　　2.2多胺耗竭对XIAP转录后调节：DFMO处理后，如前检测XIAP mRNA与HuR的结合， XIAP mRNA的稳定性和XIAP的表达，转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP3’UTR，观察DFMO通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。
　　2.3 HuR沉默对DFMO对XIAP转录后调节作用的影响： DFMO作用后，用RNA干扰将HuR沉默，后观察XIAP mRNA稳定性，XIAP的表达，以及对XIAP翻译作用的影响。
　　3．DFMO通过HuR和XIAP对细胞抗凋亡能力的影响：在DFMO作用后，沉默XIAP或HuR的表达，用TNF-α/CHX诱导凋亡，后观察细胞凋亡数量，ANNEXIN V染色，观察caspase3含量。
　　4．甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响
　　4.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响：在甘草酸作用48h后，检测细胞核内及细胞浆RNA结合蛋白HuR及TIAR的表达。
　　4.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响：甘草酸作用后检测ATF-2和XIAP的表达影响以及HuR与ATF-2内源性结合。
　　结果：
　　1. HuR与XIAP mRNA的相互作用：发现HuR不但能与XIAP mRNA3’UTR结合，还能与XIAP CR结合。
　　2.HuR对XIAP转录后调节作用
　　2.1 HuR过表达对XIAP转录后翻译的调节：
　　2.1.1 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性及蛋白质表达的影响：发现HuR过表达后的半衰期延长，稳定性增加。HuR过表达能促进XIAP蛋白质的表达，在20-200pfu/cell浓度范围内，其作用呈比例增长。同时用荧光染色发现，XIAP的分布主要在细胞浆内，HuR过表达后，其荧光量明显增加。
　　2.1.2 HuR过表达通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响：在HuR过表达后，转染XIAP CR或XIAP3’UTR的质粒，与对照组比较，HuR过表达后能增加其报告基因EGFP的表达，说明HuR能通过XIAP CR和XIAP3’UTR增加XIAP的翻译。
　　2.2 HuR沉默对XIAP转录后翻译的调节
　　2.2.1 HuR沉默对XIAP mRNA稳定性和XIAP蛋白表达的影响：HuR沉默后能加速XIAP mRNA的降解，缩短其半衰期，降低XIAP蛋白表达。
　　2.2.2 HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响：在HuR沉默后，转染XIAP CR或XIAP3’UTR的质粒，与对照组比较，HuR沉默后能降低其报告基因EGFP C1的表达，说明HuR沉默能通过XIAP CR和XIAP3’UTR降低XIAP的翻译表达。
　　3.多胺通过HuR对XIAP转录后翻译调节作用
　　3.1多胺耗竭对HuR与XIAPmRNA结合的影响：在DFMO处理后，两者的结合增强，说明多胺耗竭能使XIAP mRNA与HuR的结合增强。
　　3.2多胺耗竭对XIAP mRNA转录后调节
　　3.2.1多胺耗竭对对XIAP mRNA稳定性和翻译的影响：在DFMO处理后，与对照组比较，XIAP mRNA的稳定性明显增高，XIAP的表达增高。说明DFMO能增高HuR与XIAPmRNA的结合，从而增高XIAP mRNA的稳定性，促进XIAP蛋白质的表达。
　　3.2.2多胺耗竭通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的影响：在DFMO处理后，对于不含XIAP CR的质粒，其报告基因EGFP的表达无明显的作用，对于含XIAP CR的质粒， DFMO后能增高其报告基因EGFP N1的表达；对于XIAP3’UTR，DFMO处理后能增高其报告基因EGFP C1的表达，说明DFMO能通过XIAP CR和XIAP3’UTR增加XIAP的翻译表达。
　　3.2.3 HuR沉默逆转DFMO对XIAP转录后翻译的上调作用：在HuR沉默后，DFMO对XIAP mRNA稳定性的增高，XIAP的表达增高以及XIAP翻译的增高作用完全被逆转，而与对照组相接近。
　　4．DFMO通过HuR增高XIAP表达，从而提高细胞抗凋亡能力：
　　4.1在DFMO作用后，并用TNF-α/CHX诱导凋亡，发现在DFMO作用后，细胞抗凋亡能力大为提高， TNF-α/CHX的诱导后，与对照组比较，细胞凋亡明显减少， procaspase3的剪切明显减少。
　　4.2在DFMO作用后，沉默XIAP或HuR的表达，用TNF-α/CHX诱导凋亡，发现在沉默 HuR后，细胞抗凋亡能力明显下降，凋亡细胞数量明显增加，procaspase3的剪切明显增加，caspase3含量明显增高。表明HuR沉默能阻断DFMO的抗凋亡作用。在沉默XIAP后出现同样的情况，XIAP沉默同样能阻断DFMO的抗凋亡作用。该结果表明，DFMO的抗凋亡作用是通过HuR增高的XIAP产生作用的。
　　5．甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响
　　5.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响：在甘草酸作用48h后，能促进HuR从细胞核内向细胞浆转移，增加在细胞浆内的含量，对TIAR没有明显的影响。
　　5.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响：甘草酸能增加ATF-2的表达，但对XIAP的表达无明显影响。
　　5.3甘草酸对HuR与目的基因的mRNA内源性结合的影响：在甘草酸作用48h后，ATF-2与HuR的内源性结合明显增加。
　　结论：
　　RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达，稳定XIAP mRNA，促进XIAP的翻译表达，对XIAP进行转录后表达调节。在多胺耗竭后， HuR从细胞核内向细胞浆内转移，细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合，稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢，从而导致XIAP的翻译表达增高，DFMO通过增高细胞激浆内的HuR含量，促进XIAP的表达，从而提高细胞的抗调亡能力。甘草酸能促进HuR从细胞核内向细胞浆内转移，同时增高ATF-2的表达。

目录

声明

第一部分 引 言

第一节 RNA结合蛋白HuR与基因转录后调节

1. AREs对含有AREs的目的基因对自身的转录后调节

2.RNA结合蛋白HuR

3．HuR与AREs相互作用

第二节 多胺研究进展

1.多胺的合成

2.多胺与细胞生长

3. 多胺与细胞凋亡关系

4、多胺作用途径与TLRs/NF-κB的相互作用

5、多胺通过RNA结合蛋白对目的基因转录后调节

第三节 XIAP研究进展

1.XIAP的基因定位及分子结构

2.XIAP的生物学功能

3.XIAP的表达和调节

4.多胺耗竭调节XIAP表达

第四节 甘草酸的药理研究

1.抗肿瘤作用及机制

2.对上皮的保护作用

3．在病理状态下抑制细胞增殖

4.抗细胞凋亡

5.甘草酸作用的分子机制

第二部分 实验研究

第一章 HuR与XIAP mRNA的相互作用研究

材料与方法

3. 结果

4. 小结与讨论

第二章 HuR过表达对XIAP转录后表达调节

第一节 HuR 过表达对XIAP mRNA稳定性的影响

第二节 HuR过表达通过XIAP mRNA对XIAP翻译的影响

第三节 HuR 过表达对XIAP蛋白表达的影响

第三章 HuR沉默对XIAP转录后调节

第一节 HuR沉默对XIAPmRNA稳定性的影响

第二节 HuR沉默通过XIAP mRNA对翻译的影响

第四章 多胺对XIAP转录后调节

第一节 多胺耗竭对HuR与XIAP mRNA相互作用的影响

第二节 多胺耗竭对XIAP mRNA及稳定性的影响

第三节 多胺耗竭通过XIAP mRNA对翻译的影响

第四节 HuR沉默对多胺耗竭调节XIAP转录后表达的影响

第五章 DFMO通过HuR和XIAP对细胞抗凋亡作用的研究

1.细胞分组

2.实验方法

3.结果：

4.小结

第六章 甘草酸对RNA结合蛋白及目的基因的表达影响

1.细胞分组及处理

2.方法：

3.结果

4．小结

总结与讨论

参考文献

附录一

附录二

附录三

致谢