大鼠腹腔肥大细胞分离及鱼腥草注射液致其脱颗粒研究

摘要

1.研究目的：
　　由于中药注射液发展历史不长，成份复杂，制作工艺无统一标准，随着临床广泛应用，其不良反应报道屡有发生。过敏反应是其中最主要的，最严重的反应，鱼腥草注射液致过敏反应报道最多。其中对鱼腥草注射液有过敏症状的患者无过敏史的有49％左右，也只确定少部分患者体内血清IgE明显增高[1,2]。所以鱼腥草注射液所致的“过敏反应”部分是类过敏反应（Anaphylactoid Reaction）的表现，而不是过敏（Anaphylactic Reaction）。因类过敏反应在症状上和过敏反应极其相似，在临床症状上难以区分两者，故常有类过敏反应被误认为过敏反应。
　　现有对鱼腥草注射液安全性评价的方法大多是通过动物体内实验。体内实验提供了药物反应的真实环境，然体内实验周期长，操作复杂，影响因素多，不够敏感；而体外实验可以弥补体内实验的不足，且灵敏度高。本实验尝试将鱼腥注射液直接作用于原代肥大细胞的体外实验方法，对鱼腥草注射液致类过敏反应的做一个初步评价。
　　肥大细胞是过敏反应和类过敏反应中重要的效应细胞，它能脱颗粒释放炎症介质，引起过敏样症状，它是类过敏反应的重要载体。然现ATCC（American type culture collection）所存肥大细胞株皆是小鼠肥大细胞株，大鼠的肥大细胞多由RBL-2H3细胞代替。RBL-2H3大鼠嗜碱细胞成纤维细胞，作为肥大细胞研究不合适[3]。许多大鼠肥大细胞实验通过分离原代细胞实现，Lennart等[4]创立密度梯度离心分离大鼠腹腔肥大细胞方法，在本次的实验考虑在Lennart等方法基础上改良分离肥大细胞的方法以提取肥大细胞。
　　2.方法：
　　2.1.大鼠腹腔肥大细胞的分离与鉴定
　　在乙醚大鼠麻醉后，放血处死大鼠，用12ml无Ca2+Tyrode液冲洗腹腔，轻揉3min后，提取腹腔冲洗液，离心并弃去上清液，0.75ml无Ca2+Tyrode液重悬细胞后，并与3.5ml的1.110g/ml的percoll液混合，经130g，15min离心后，弃去最上面的2.5ml的悬液，所得的细胞即为肥大细胞。用台盼蓝染色液检测细胞活性，用甲苯胺蓝染色液检测其纯度，在电子显微镜下观察细胞微结构。用C48/80刺激所分离的细胞以观察肥大细胞的脱颗粒活性。
　　2.2.鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒
　　将1/4稀释的鱼腥草注射液直接刺激分离的肥大细胞，与Trition作用的总酶组肥大细胞、C48/80刺激的阳性组肥大细胞和无药物刺激的空白对照组肥大细胞同时置于37℃，5％CO2中30min。30min后，通过β-氨基己糖苷酶对β-氨基己糖的消化量，检测410nm下各组吸光度，应用公式计算出各组β-氨基己糖苷酶释放率。
　　2.3.不同浓度鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒
　　将鱼腥草注射液1/2、1/4、1/6和1/8稀释成不同的浓度直接刺激肥大细胞，与总酶组、阳性对照组和空白对照组的细胞同时37℃，5％CO2中45min，45min后，通过细胞液上清中β-氨基己糖苷酶对β-氨基己糖的消化量，检测410nm下各组吸光度，应用公式计算出各组β-氨基己糖苷酶释放率。进而对不同浓度注射液所致的肥大细胞的β-氨基己糖苷酶释放率进行一个比较。
　　将鱼腥草注射液1/2、1/4和1/8稀释成不同的浓度直接刺激肥大细胞，与阳性对照组和空白对照组的细胞同时37℃，5％CO2中45min，45min后，通过细胞液上清中组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下的结合产生荧光，检测其荧光强度，以测定各组肥大细胞释放的组胺含量。进而对不同浓度注射液所致的肥大细胞释放的组胺量进行一个比较。
　　2.4.不同批号鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒
　　将批号分别为100701、100801、100804和100805的鱼腥草注射液稀浓度直接刺激肥大细胞，与总酶组、阳性对照组和空白对照组的细胞同时37℃，5％CO2中45min，45min后，通过细胞液上清中β-氨基己糖苷酶对β-氨基己糖的消化量，检测410nm下各组吸光度，应用公式计算出各组β-氨基己糖苷酶释放率。进而对不同批号注射液所致的肥大细胞的β-氨基己糖苷酶释放率进行一个比较。
　　将批号分别为100701、100801、100804和100805的鱼腥草注射液稀浓度直接刺激肥大细胞，与阳性对照组和空白对照组的细胞同时37℃，5％CO2中45min，45min后，通过细胞液上清中组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下的结合产生荧光，检测其荧光强度，以测定各组肥大细胞释放的组胺含量。进而对不同批号注射液所致的肥大细胞释放的组胺量进行一个比较。
　　3.结果：
　　3.1.分离大鼠腹腔肥大细胞
　　改良的分离大鼠腹腔肥大细胞方法所分离的细胞状态良好，存活率在99％以上；肥大细胞纯度在90％以上，电子显微镜下细胞微结构图片，具有肥大细胞的特征。C48/80刺激肥大细胞，其脱颗粒活性良好，所释放的β-氨基己糖苷酶率50.91%±3.13%和组胺量2.274±0.041ng/ml显著高于空白对照组2.59%±0.10%和0.013±0.013ng/ml。
　　3.2.鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒
　　阳性对照组肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率51.49％±1.91％明显高于注射液组和空白对照组；鱼腥草注射液组β-氨基己糖苷酶释放率为8.20％±0.88％，高于空白对照组3.01％±0.3％，各组间有显著差异。
　　3.3.不同浓度鱼腥草注射液致肥大细胞脱颗粒
　　不同浓度的鱼腥草注射液所致的肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率分别是：1/2稀释的鱼腥草注射液组为35.83％±5.84％；1/4稀释的鱼腥草注射液组为15.91％±0.91％；1/6稀释的鱼腥草注射液组为14.79％±1.19％；1/8稀释的鱼腥草注射液组为12.19％±1.11％，各组间有显著差异。β-氨基己糖苷酶释放率随着鱼腥注射液的浓度降低而降低；不同浓度的鱼腥草注射液所致的肥大细胞组胺释放量分别是：1/2稀释的鱼腥草注射液组为4.26±0.51ng/ml；1/4稀释的鱼腥草注射液组为3.10±0.08ng/ml；1/8稀释的鱼腥草注射液组为2.58±0.02ng/ml，各组间有显著差异。组胺的释放量随着鱼腥草注射液的浓度降低而降低。
　　3.4.不同批号鱼腥草注射液致肥大细胞脱颗粒
　　不同批号的鱼腥草注射液所致的肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率分别是：100701批号的鱼腥草注射液组为19.88％±4.36％；100801批号的鱼腥草注射液组为26.60％±8.69％；100804批号的鱼腥草注射液组为29.48％±4.16％；100805批号的鱼腥草注射液组为16.25％±4.03％，各批号鱼腥草注射液组肥大细胞的β-氨基己糖苷酶释放率差异显著性不强。不同批号的鱼腥草注射液所致的肥大细胞组胺释放量分别是：100701批号的鱼腥草注射液组为2.26±0.37ng/ml；100801批号的鱼腥草注射液组为2.86±0.574ng/ml；100804批号的鱼腥草注射液组为2.87±0.26ng/ml；100805批号的鱼腥草注射液组为2.11±0.28ng/ml，各批号鱼腥草注射液组肥大细胞的组胺释放量无显著差异。
　　4.结论：
　　4.1.改良的分离细胞方法可行
　　应用改良的分离腹腔肥大细胞方法分离出的肥大细胞活性良好，纯度高，可以用于肥大细胞的各项研究中。
　　4.2.鱼腥草注射液体外可促进肥大细胞脱颗粒
　　鱼腥草注射液可以引起原代大鼠腹腔肥大细胞的脱颗粒而释放β-氨基己糖苷酶和组胺，提示鱼腥草有致类过敏性的可能性，且与鱼腥草注射液的剂量相关。不同批号的鱼腥草注射液对肥大细胞脱颗粒的影响无显著差别。
　　总之，本论文介绍了一种分离的大鼠腹腔肥大细胞方法，并体外研究了鱼腥草注射液对肥大细胞脱颗粒珠影响，显示此方法简便可行，鱼腥草注射液能促进肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶和组胺。

目录

声明

引言

第一部分研究背景及立题依据

第一章研究背景

1 中药注射液致过敏反应报道

2 鱼腥草注射液的致过敏反应报道

3 类过敏反应

4 类过敏评价方法

5 肥大细胞脱颗粒

第二章立题依据与研究内容

1 立题依据

2 研究内容

第二部分实验研究与结果分析

第一章 大鼠腹腔肥大细胞的分离与鉴定

1 实验材料：

2 实验方法：

3 实验结果：

4 讨论

第二章 鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒

1 实验材料：

2 实验方法：

3 实验结果：

4 讨论

第三章 不同浓度鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒

1 实验材料：

2 实验方法：

3 实验结果：

4 讨论

第四章 不同批号鱼腥草注射液刺激肥大细胞脱颗粒

1 实验材料：

2 实验方法：

3 实验结果：

4 讨论

第三部分 结语

1 总结

1.1 分离大鼠腹腔肥大细胞方法可行

1.2 不同浓度鱼腥草注射液刺激肥大细胞

1.3 不同批号的鱼腥草注射液刺激肥大细胞

2 不足

3 展望

3.1. 与RBL-2H3细胞的体外评价方法进行比较

3.2. 工艺对注射液致类过敏性的影响

3.3. 注射液所致的过敏症状有过敏反应和类过敏反应的重叠

参考文献

附录

致谢