β细辛醚减少AD小鼠脑内老年斑发挥抗凋亡作用的研究

摘要

背景: 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)即老年性痴呆，是老年人最常见的痴呆类型。随着老龄化社会的到来，老年人群中痴呆的患病率急剧上升，2011年阿尔茨海默病协会公布的调查结果显示，全球约有3650万人患有AD，估计到21世纪中叶，全球患者总数将达到1.068亿人，阿尔兹海默病将成为一个重要的公共健康问题，因此在全球范围内进行AD的治疗及相关研究是十分必须和紧迫的。 目的: 在AD的众多发病学说中，有许多证据表明β样淀粉斑块对AD的致病具有重要作用。β细辛醚是中药石菖蒲的活性成分，许多研究表明β细辛醚可阻断脑内神经凋亡改善AD模型动物的学习记忆能力，本研究试以国际公认的痴呆动物模型APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为动物模型，探讨β细辛醚对APPswe/PS1dE9脑内β样淀粉斑块的治疗作用及其可能的作用机制。 方法: 1.把4.5月龄SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因阳性小鼠55只，随机分为模型组、β细辛醚低剂量组、中剂量、高剂量配伍组、盐酸多奈哌齐阳性药物对照组，使用同月龄同背景B6鼠12只作为正常对照组。 2.β细辛醚低、中、高剂量给药剂量分别为21.2mg/kg/d，42.4mg/kg/d，84.8mg/kg/d，盐酸多奈哌齐阳性药物对照组给药剂量为2mg/kg/d，模型组和转基因阴性对照组予以蒸馏水灌胃，每日1次，给药共2.5个月。 3.检测指标 (1)用尼氏染色法检测小鼠海马各区域神经元尼氏小体的状况，用Westernblotting法检测小鼠脑组织Bcl2、Bax的表达，并用caspase活性检测法检测小鼠脑内Caspase3、Caspase9活性。 (2)用硫磺素染色法检测小鼠皮质和海马淀粉样斑块沉积状况，Westernblotting法和免疫组织化学的方法检测小鼠脑内Aβ1-42蛋白的表达量，酶联免疫反应法检测小鼠大脑分泌的Aβ1-42的量。 (3)用Western blotting法检测小鼠脑内APP、PS1的表达量。 (4)用Western blotting法检测小鼠脑内Aββ转运受体—RAGE的表达量。 结果: 实验一:β细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠神经细胞形态学及对凋亡相关指标的影响 1.尼氏染色结果显示:与正常组相比，模型小鼠海马各区域神经元损伤明显，与模型组相比，β细辛醚治疗组小鼠脑内神经元病变均明显改善，其中β细辛醚中剂量改善作用最为明显。 2.凋亡相关指标结果提示:与正常组相比，模型组小鼠皮质Bcl2/Bax的相对表达量明显下降(P＜0.01)，不同浓度的β细辛醚治疗组均可上调Bcl2/Bax的相对表达量(P＜0.01)，其中β细辛醚中剂量组上调作用最为明显。 3.Caspase活性测定结果提示:与正常组相比，模型组小鼠Caspase3、Casapase9活性有增强的趋势(P＞0.05)，与模型组相比，不同浓度的β细辛醚治疗组有上调模型小鼠脑内Bcl2/Bax的相对表达量的趋势(P＞0.05)。 实验二:β细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠脑内β样淀粉蛋白和Aβ1-42的影响 1.硫磺素染色结果提示:与正常组小鼠相比，模型组小鼠海马、皮质区均可见明显的淀粉样斑块沉积(P＜0.01)。与模型组小鼠相比，不同浓度的β细辛醚治疗组可减少小鼠脑内β样淀粉样斑块的沉积(P＜0.01)，其中，中剂量组的治疗作用最为明显。 2.Western blotting结果提示:和正常组小鼠相比，模型组小鼠皮质内Aβ1-42蛋白的表达量明显增多(P＜0.01)，中剂量和高剂量β细辛醚治疗组可下调模型小鼠皮质内Aβ1-42的表达(P＜0.01)，其中，中剂量组的治疗作用最为明显。 3.免疫组织化学染色结果提示:和正常组小鼠相比，模型组小鼠海马、皮质区Aβ1-42阳性染色颗粒明显增加，不同浓度的β细辛醚治疗组可减少模型小鼠海马和皮质区Aβ1-42的沉积。 4.Elisa结果提示:和正常组小鼠相比，模型组小鼠皮质Aβ1-42分泌量有增多趋势(P＞0.05);和模型组小鼠相比，不同浓度的β细辛醚有下调模型小鼠脑内Aβ1-42分泌量的趋势(P＞0.05)。 实验三:β细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠脑内APP、PS1表达的影响 Western blotting结果提示:(1)和正常组小鼠相比，模型组小鼠皮质内APP的表达量明显增多(P＜0.01)，β细辛醚治疗组未显示出明显调节作用。(2)和正常组小鼠相比，模型组小鼠皮质内PS1的表达量明显增多(P＜0.05)，中剂量的β细辛醚治疗组可下调模型小鼠脑内PS1的表达(P＜0.05)。实验四:β细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ转运受体-RAGE表达的影响 Western blotting结果提示:与正常组相比，模型组小鼠皮质的RAGE表达量明显增多(P＜0.05)，与模型组相比，中剂量组、高剂量的β细辛醚治疗组可下调模型小鼠RAGE的表达(P＜0.05)，其中，中剂量组作用最为明显。 结论: (1)β细辛醚可改善APP/PS1双转基因小鼠脑内神经元损伤，抑制神经细胞凋亡。 (2)β细辛醚发挥抗凋亡作用可能与其减少AD模型小鼠脑内淀粉样斑块的沉积，下调AD模型小鼠脑内Aβ1-42表达有关。 (3)β细辛醚减少AD模型小鼠脑内Aβ1-42表达可能与其减少PS1表达，从而抑制Aβ1-42的生成有关。 (4)β细辛醚减少AD模型小鼠脑内Aβ1-42表达也可能与其减少Aβ转运受体RAGE的表达，从而减少Aβ1-42转运入脑有关。 (5)β细辛醚可能从双向途径调控脑内Aβ的含量 (6)β细辛醚可能是治疗AD的潜在药物。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 AD的发病机制和治疗研究

一、Aβ级联学说

二、靶向Aβ的AD治疗策略

第二节 血脑屏障对AD的发病和治疗的重要意义

第三节 石菖蒲及其活性成分治疗老年性痴呆的潜在优势

第二章 实验研究

第一节 β细辛醚对APP／PS1双转基因小鼠神经细胞形态学及对凋亡相关指标的影响

一、材料方法

二、尼氏染色法检测β细辛醚对APP／PS1双转基因小鼠脑内神经元尼氏小体的影响

三、Western blotting检测APP／PS1双转基因小鼠脑内Bcl2、Bax的表达

四、Caspase活性检测法检测APP／PS1双转基因小鼠脑内Caspase3、Caspase9的表达

五、实验结果

第二节 β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠老年斑及Aβ1-42的影响

一、硫磺素染色法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠脑内老年斑的影响

二、Western blotting法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠大脑Aβ1-42表达的影响

三、免疫组织化学法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠大脑Aβ1-42表达的影响

四、酶联免疫反应法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠大脑分泌Aβ1-42表达的影响

五、实验结果

第三节 β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠APP、PS1的影响

一、Western blotting法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠皮质APP、PS1的影响

二、结果

第四节 β细辛醚对APP／PS1双转基因小鼠皮质RAGE的调节

一、Western blotting法检测β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠皮质RAGE蛋白表达的影响

二、β细辛醚对APPswe／PS1dE9双转基因小鼠皮质RAGE表达的影响

第五节 讨论

一、Aβ和神经凋亡

二、以减少脑内Aβ水平为核心的治疗策略

三、对本实验的讨论

结语

参考文献

研究生在学期间发表论文情况

致谢