去铁敏对Alzheimer病转基因小鼠脑内Aβ老年斑形成和tau蛋白磷酸化的抑制作用及其机制

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是常见于老年人的一种神经退行性疾病，以进行性认知、学习和记忆功能障碍为主要临床表现。当今，老龄化进程加剧，AD的发病率逐年上升，已成为继心、脑血管疾病和恶性肿瘤之外的重要致死性疾病。AD的特征性病理改变主要是脑内神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的沉积形成老年斑(senile plague，SP)和胞内神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)。 Aβ是β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）经β-和γ-分泌酶异常剪切的酶切裂解产物，神经元内tau蛋白的过度磷酸化导致NFTs的形成。实际上，AD的发病机制目前尚未完全阐明，近年研究表明，铜、铁和锌等过渡金属在皮层和海马等脑区过量沉积，且过渡金属离子与APP、Aβ和Tau蛋白密切相关，提示这些金属可能参与了AD的发病和进展等病理生理过程。
　　 作为一种具有氧化还原活性的过渡金属，铁在AD的发病过程中具有重要作用。过量的游离铁，尤其是亚铁离子可通过Fenton反应，引发氧化应激，并最终导致细胞死亡。体外研究发现，Aβ蛋白具有金属结合位点，铁可以增加Aβ的神经细胞毒性，Aβ与铁离子相螯合以减少游离铁的含量，这可能是Aβ蛋白在脑内聚集，形成老年斑的原因之一。另外，Fe3+可以和过度磷酸化的tau蛋白相结合，促进聚合成双股螺旋丝的tau蛋白(paried helical filaments，PHFs)聚集，形成NFTs。在AD患者的脑组织标本及APP转基因小鼠脑内，NFTs富集区域的病变神经元和老年斑中均有铁沉积。此外，铁可作用于APP mRNA的IRE元件，增强内源性APP的翻译和蛋白的表达。据此，我们推测铁参与AD的发病过程，合理调节体内铁稳态可能成为治疗AD的新靶点。
　　 有趣的是大量研究证据表明金属螯合剂具有神经保护作用，可考虑用于AD的治疗。早期进行的小规模临床实验，发现铁螯合剂去铁敏(Desferrioxamine，DFO)能够减缓AD患者的病情进展。去铁敏是一种高选择性铁离子螯合剂，已被广泛用于临床治疗铁负荷疾病。体外研究表明，一方面，DFO能够抑制Aβ聚集，并可溶解老年斑中的Aβ纤维。另一方面，DFO还能抑制APP蛋白的表达，进而减少Aβ分泌。所以，通过螯合细胞内的铁离子，抑制APP的合成和Aβ的神经毒性是一种合理的选择。但DFO存在难以通过血脑屏障，组织特异性差，长期应用可导致贫血等毒副作用，对于病程漫长的神经退行性疾病，临床应用更应合理进行。所以对它的进一步研究曾一度搁置。但近年的探索发现，DFO可用于多种神经系统疾病的治疗，除发挥其铁螯合作用外，还可直接清除羟基化的自由基，阻止或减少这些自由基的毒性，并诱导缺氧诱导因子1(hypoxia inducible-factor1，HIF-1)的表达。更令人鼓舞的是，Hanson等的研究发现，通过鼻腔给药，DFO亦能有效地改善大鼠的脑缺血再灌注损伤。这提示将DFO用于AD转基因鼠模型可作为防治AD的潜在研究方向。
　　 综上所述，铁含量异常可能导致AD脑内Aβ积聚、tau蛋白异常磷酸化，改善铁代谢紊乱是治疗AD的一种潜在策略。为深入探讨铁在AD发病及老年斑形成中可能的作用，并验证DFO鼻腔给药用于AD防治的效果及机制。本研究以双转染人APP695swe基因和人早老素(presenilin，PS1)突变基因(double transgenicAPPswe/PS1 De9，APP/PS1)的AD模型小鼠作为实验对象，分别给予动物高铁和/或DFO处理，结合行为学、形态学和分子生物学等手段，检测铁超载和鼻内给予DFO对APP/PS1小鼠的学习记忆能力、脑内老年斑形成、tau蛋白异常磷酸化的影响及其机制。同时采用稳定转染APPsw基因的SH-SY5Y细胞，体外观察调节铁稳态对APP代谢和磷酸化tau蛋白的表达变化，从而揭示铁离子参与AD病理过程的证据及机制。
　　 实验方法：
　　 1、DFO鼻腔给药对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ老年斑形成、tau蛋白磷酸化和认知功能影响及其机制的研究40只6月龄雄性APP/PS1转基因鼠随机均分为4组:(1)正常对照组;(2)高铁组(喂饲含FeCl3的水，浓度10mg/ml);(3)铁+DFO组（喂饲含FeCl3的水，浓度10mg/ml;同时，滴鼻法给予20mg/kg的DFO处理3月，隔日一次）;(4)DFO组（滴鼻法给予20mg/kg的DFO处理3月，隔日一次）。当小鼠到9月龄时，做Morris水迷宫实验，检测各组小鼠的学习记忆能力的变化。随后心脏取血并分离血清，用原子吸收光谱法检测分析各组小鼠血清铁、铜和锌的变化。断头取脑，大脑左半球固定做石蜡切片，右半球分离皮层和海马，做分子生物学检测。应用免疫组织化学技术检测各组小鼠脑内Aβ老年斑的分布变化;应用RT-PCR技术检测AD小鼠脑内APP mRNA的表达;应用Western blot技术检测各组小鼠脑内APP代谢相关蛋白、tau蛋白的磷酸化及对其影响的相关信号转导通路蛋白表达。
　　 (2)DFO对稳定转染APPsw的SH-SY5Y细胞内APP代谢及tau蛋白磷酸化的影响及其机制研究选用稳定转染APPsw的SH-SY5Y细胞，观察DFO对AD样病理变化的影响及机制。应用Western blot技术检测APPsw细胞内APP代谢、tau蛋白的磷酸化及影响其磷酸化的相关信号转导系统蛋白的表达;应用免疫荧光与共聚焦激光扫描显微镜检测APPsw细胞内p-tau的表达与p-CDK5、p35/25表达的关系。
　　 实验结果：
　　 1、DFO鼻腔给药和或铁超载对APP/PS1转基因鼠体重及脑、血清铁含量的影响高铁组和铁+DFO组的转基因鼠体重减轻，血清铁含量增高，但脑组织铁含量无显著升高。铁螯合剂DFO对转基因鼠的体重和血清、脑铁水平均无明显影响。
　　 2、DFO鼻腔给药和或铁超载对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响Morris水迷宫结果显示:高铁组转基因小鼠的学习和记忆能力均显著下降，而DFO能一定程度改善高铁喂养对APP/PS1转基因小鼠学习、记忆能力的影响，并且其本身也能显著改善APP/PS1转基因小鼠的记忆能力。
　　 3、DFO鼻腔给药和或铁超载对APP/PS1转基因小鼠脑内APP代谢的调节(1)铁超载导致APP/PS1小鼠脑内APP蛋白表达水平及其磷酸化水平显著升高，老年斑生成增加。DFO能减缓铁对老年斑形成的促进作用，亦能直接减少老年斑的数量和体积。然而，二者对APPmRNA的水平无影响。
　　 (2) Western blot结果显示:铁超载能增加BACE1、PS1、sAPPβ和C99等蛋白的含量，减少ADAM10、sAPPα和C83等蛋白的水平;DFO处理则降低转基因鼠脑内的BACE1、PS1、sAPPβ和C99的蛋白含量，增加ADAM10和sAPPα和C83等蛋白的表达。
　　 4、DFO鼻腔给药和或铁超载对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响免疫组化和Western blot结果显示:长期铁喂饲使APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白的几个重要磷酸化位点(Thr205、Thr231和Ser396)的磷酸化水平增高，给予DFO反转这种增加，并且单独给予DFO能有效地降低Ser396位点的磷酸化。而各实验组小鼠脑内总tau蛋白表达无显著差异。
　　 进一步的研究表明，铁暴露导致的tau蛋白过度磷酸化主要由CDK5信号通路介导，而GSK3在DFO减弱tau蛋白磷酸化水平中发挥更为重要的作用。
　　 5、去铁敏对稳定转染人APPsw的SH-SY5Y细胞APP代谢及tau蛋白磷酸化的影响(1)去铁敏对APPsw细胞内APP代谢的影响Western blot结果显示:100μM的硫酸亚铁增强APPsw细胞内BACE1、PS1、sAPPβ和C99等蛋白的表达，给予DFO处理后这些变化被抑制。而DFO直接作用于稳定转染人APPsw的SH-SY5Y细胞，能增强ADAM10的表达，减少BACE1的表达。因而，促进APPsw细胞α-分泌酶水解产物sAPPα和C83的生成，降低β-分泌酶水解产物sAPPβ和C99的含量。
　　 (2)去铁敏对APPsw细胞内tau蛋白磷酸化的影响100μM的硫酸亚铁增强APPsw细胞内tau蛋白磷酸化水平，与CDK5、p-CDK5的高表达一致。DFO使APPsw细胞内p-GSK-3高表达，而Ser396位点上的tau蛋白磷酸化表达水平降低。而且在APPsw细胞中，p-tau与p-CDK5、p35/25的表达有共同趋势。
　　 结论：
　　 1、铁超载可促进APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑的生成、tau蛋白异常磷酸化，加剧认知功能障碍程度。
　　 2、同时给予去铁敏能显著抑制铁超载诱发的APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑生成增多、tau蛋白异常磷酸化加剧及由此引起的认知功能障碍加重。
　　 3、去铁敏可减少APP的表达、降低其磷酸化水平，调节APP向非Aβ生成途径代谢。
　　 4、去铁敏可抑制GSK-3蛋白活性、调节CDK5信号通路，降低tau蛋白磷酸化。
　　 5、滴鼻法给予APP/PS1小鼠去铁敏，没有影响血清铁水平，但能温和减少脑内铁等金属离子的含量，并有效地延缓APP/PS1转基因小鼠病理进展，提示去铁敏鼻腔给药可能成为防治AD的一种有效方式。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 去铁敏对APP／PS1转基因鼠脑内Aβ老年斑形成的影响及相关机制研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 去铁敏对tau蛋白磷酸化的影响及相关机制研究

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

在学期间科研成绩

致谢

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