茜草药材及其配方颗粒质量和体外抗炎作用初步研究

摘要

目的: 茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根茎，用于行血凉血、祛瘀通经，为治血热诸症之要药，现代药理表明其具有抗炎镇痛作用。而茜草配方颗粒是茜草饮片经浸提、浓缩、干燥、制粒等工艺精制而成的单味中药产品。由于药物成分比较复杂，中药配方颗粒在生产过程中，提取、精制使成分损失比较严重，其所含有效成分与中药饮片存在一定差异，且部分药物作用机理尚不清楚，给药物的疗效带来了一定的影响，使中药配方颗粒剂的标准化和质量控制存在一定困难。茜草配方颗粒目前还缺乏比较完整的质量控制体系，而市场流通的茜草药材质量参差不齐，药典规定的测定方法较为繁琐，可操作性不强，因此本研究拟通过薄层鉴别、主要成分含量测定、指纹图谱对茜草及茜草配方颗粒质量进行系统研究，建立茜草药材及配方颗粒质量评价方法，为茜草配方颗粒质量评价提供可靠的评价标准和依据，为配方颗粒成为一种安全、有效的产品打下基础。 方法: 1.茜草药材质量分析 参考《中国药典》2010版，对茜草药材进行质量分析，以大叶茜草素、茜草对照药材为对照，采用薄层色谱法对茜草药材进行定性鉴别;采用HPLC测定大叶茜草素、羟基茜草素的含量;建立茜草药材UHPLC-DAD指纹图谱，探讨其有效的质量评价方法。 2.茜草配方颗粒质量分析 对厂家提供的12批茜草配方颗粒进行研究，以大叶茜草素、茜草对照药材为对照对茜草配方颗粒进行薄层鉴别，以大叶茜草素、羟基茜草素为指标，测定配方颗粒含量;构建配方颗粒水溶液和脂溶性成分的HPLC-PDA指纹图谱研究，应用“中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件”与药材水提液进行相似度评价。 3.体外抗炎作用初步研究 以LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7为炎症模型，采用MTT法确定药物浓度对细胞活性的影响，从而确定给药浓度范围。RAW264.7细胞培养液中分别添加大叶茜草素(2、10、50μg/mL)、羟基茜草素（2、10、40μg/mL）、茜草配方颗粒(40、200、800μg/mL);然后再添加LPS刺激，采用ELISA法和RT-PCR法检测各组药物对LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的分泌和相关基因表达的影响。 成果: 1.茜草药材质量分析 薄层鉴别供试品色谱中，在与对照药材和对照品相应的位置上，均显相同颜色的斑点，薄层色谱分离度较好，斑点清晰。 通过条件优化，建立了大叶茜草素、羟基茜草素的含量测定方法，结果显示大叶茜草素和羟基茜草素分别在19.34～161.20μg/mL（r2=0.9999）和12.16～101.30μg/mL(r2=0.9997)范围内呈良好线性，平均回收率分别为97.27％(RSD=1.91％)和100.00％(RSD=1.87％)，22批茜草中大叶茜草素素含量为0.05％～1.63％，羟基茜草素含量为0.35％～0.91％，其中有12批含量不符合药典规定。 构建了茜草药材UHPLC-DAD指纹图谱，并标定了9个特征峰，其中确认了2个已知峰，合格药材图谱与共有模式的相似度为0.911～0.987，不合格药材图谱与共有模式的相似度为0.791～0.942。 2.茜草配方颗粒质量分析 建立了茜草配方颗粒的薄层鉴别方法，薄层鉴别供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，但大叶茜草素相应的斑点颜色较浅;11批茜草配方颗粒中大叶茜草素含量为0.0000％～0.0118％，羟基茜草素含量为0.0050％～0.0121％，含量低;构建了茜草配方颗粒水溶液（11个共有峰）及脂溶性成分(9个共有峰)的HPLC-PDA指纹图谱，剔除了相似度较低的批次（1批），其他批次的水溶液图谱与共有模式相似度为0.886～0.995，脂溶性成分图谱与共有模式相似度为0.952～0.992，配方颗粒与汤剂图谱相似度较低。 3.体外抗炎作用初步研究 LPS诱导能使RAW264.7细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10提高，形成炎症模型。ELISA结果显示，茜草及其配方颗粒主要通过抑制LPS诱导的细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-6，部分组别能抑制IL-1β的分泌，而对IL-10则无明显抑制或促进作用。RT-PCR结果显示，各组别均能表达TNF-α、IL-1β基因，对IL-6基因的表达有抑制作用。 结论: 本实验对茜草药材及配方颗粒进行了质量分析和抗炎活性研究。优化了茜草药材的含量测定方法，与药典方法相比，该方法对指标成分提取完全，操作简单，稳定可靠;建立了配方颗粒薄层鉴别方法，对茜草配方颗粒进行了含量测定，但选用指标不适于配方颗粒，需另选指标。分别建立了茜草药材、茜草配方颗粒水溶液、脂溶性成分的高效液相色谱指纹图谱，对配方颗粒和药材水提液成分进行对比。茜草及其配方颗粒的质量分析显示了当前市场上茜草药材质量堪忧，而药材的质量评价系统并不适用于配方颗粒。另外抗炎作用的初步研究对药材指标成分及配方颗粒的抗炎活性进行研究，证明茜草及其配方颗粒均能抑制促炎因子的生成，为质量标准优选指标成分提供了药效基础。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 茜草研究现状

1．1．1 本草考证

1．1．2 植物性状

1．1．3 化学成分

1．1．4 药理作用

1．1．5 临床应用

1．1．6 小结与讨论

1．2 中药配方颗粒

1．2．1 概念

1．2．2 研究和应用现状

1．2．3 优势及存在问题

1．2．4 配方颗粒与药材、汤剂

1．3 质量控制研究思路

1．3．1 概述

1．3．2 研究手段

1．3．3 质量控制发展趋势

1．4 抗炎作用研究进展

1．4．1 概述

1．4．2 抗炎药效评价

1．4．3 抗炎作用机理

1．5 小结

1．6 本研究工作的总体思路、主要研究方法和预期结果

第二章 茜草药材质量控制

2．1 水分测定

2．1．1 实验材料与设备

2．1．2 方法与结果

2．2 薄层鉴别

2．2．1 实验材料与设备

2．2．2 方法与结果

2．3 含量测定

2．3．1 实验材料与设备

2．3．2 方法与结果

2．4 指纹图谱研究

2．4．1 实验材料与设备

2．4．2 方法与结果

2．5 小结

第三章 茜草配方颗粒质量控制

3．1 薄层鉴定

3．1．1 实验材料与设备

3．1．2 方法与结果

3．2 含量测定

3．2．1 实验材料与设备

3．2．2 方法与结果

3．3 指纹图谱

3．3．1 实验材料与设备

3．3．2 方法与结果

3．4 小结

第四章 体外抗炎初步研究

4．1 实验材料与设备

4．1．1 实验细胞

4．1．2 实验药物

4．1．3 引物

4．1．4 普通试剂

4．1．5 主要生物学试剂

4．1．6 溶液配制

4．1．7 实验设备

4．2 细胞培养及造模

4．2．1 细胞复苏

4．2．2 细胞传代

4．2．3 细胞形态

4．2．4 造模

4．3 实验分组

4．4 MTT法测定细胞活性

4．5 药物对细胞因子分泌的影响

4．6 药物对细胞因子基因表达的影响

4．6．1 总RNA提取

4．6．2 反转录

4．6．3 PCR扩增

4．7 小结

结语

参考文献

在校期间发表论文情况

致谢