体外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用

摘要

目的:
　　研究miR-155在HBV慢性感染的细胞模型中对免疫应答的调节及其抗HBV作用。
　　方法:
　　1.提取人肝癌细胞株总DNA作为模板，通过PCR扩增miR-155前体序列，酶切后退火连接到pmR-mCherry质粒，构建pmiR-155真核表达载体，然后进行菌落PCR、质粒双酶切和DNA测序鉴定。
　　2.利用脂质体法将pmiR-155真核表达质粒转染到HepG2.2.15细胞，同时设空载组（pmR-mCherry质粒）、转染试剂组、空白组和对照组（HepG2细胞）。转染后24 h荧光显微镜下观察细胞内红色荧光蛋白的表达情况，荧光实时定量PCR检测各组细胞内miR-155表达量。
　　3.重组质粒pmiR-155经去内毒素提取后，转染到人肝癌细胞株。收集转染后各组细胞及细胞培养上清液，应用RT-PCR检测各组SOCS-1 mRNA的变化，Western Blot检测各组SOCS-1蛋白的变化，ELISA检测各组细胞的IFN-γ及IL-2的分泌量变化。
　　4.重组质粒pmiR-155转染到HepG2.2.15细胞，同时设空载组(pmR-mCherry质粒)、转染试剂组、空白组。转染后24h、48h、72h，应用荧光实时定量PCR检测各组细胞内miR-155表达量，化学发光法定量检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg变化，荧光实时定量PCR定量检测HBV DNA拷贝数的变化。
　　结果:
　　1.通过菌落PCR、质粒双酶切及DNA测序鉴定，证实miR-155前体序列成功插入pmR-mcherry真核表达载体，pmiR-155真核表达载体构建成功。
　　2.转染后24h、48h、72h各组细胞进行荧光观察，载体中红色荧光蛋白有较好的表达，转染效率达到50％以上。荧光实时定量PCR结果表明，以空白组为基准，重组载体组细胞内所表达的miR-155明显增加，具有显著意义(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR结果示:重组载体组SOCS-1 mRNA的表达量(0.63±0.09)显著低于空白组(P＜0.05);Western Blot结果示:重组载体组内SOCS-1蛋白表达量(0.37±0.07)显著低于空白组(P＜0.05);ELISA结果示:以空白组为基准，重组载体组与对照组所分泌的IFN-γ、IL-2水平均显著高于空白组(P＜0.05)，而空载组及转染试剂组与空白组相似。
　　4.化学发光法结果示:以空白组为基准，转染后重组载体组细胞所分泌HBsAg、HBeAg明显减少，而空载组及转染试剂组与空白组相似。转染后48h重组载体细胞内miR-155对HBsAg和HBeAg抑制最为明显，抑制率分别为(83.96±1.52)％和(79.60±8.71)％。荧光实时定量PCR检测结果示:转染后24h、48h、72h，以空白组为基准，重组载体组中HBV DNA拷贝数明显减少，而空载组及转染试剂组未见明显差异。其中重组载体组内miR-155对HBV DNA的抑制率分别为(51.87±0.36)％、(43.67±1.51)％和(68.21±6.02)％。相关性分析发现miR-155与HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达复制呈负相关(r＜0)。
　　结论:
　　在HBV慢性感染的细胞模型HepG2.2.15中，过表达的miR-155可通过增强抗病毒免疫效应抑制HBV的复制及表达。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 HBV的流行病学

1．1．1 HBV的病原学

1．1．2 HBV的生命周期

1．1．3 HBV与免疫耐受

1．1．4 HBV的药物治疗

1．2 RNA干扰

1．2．1 siRNA

1．2．2 miRNA

1．3 小结

第二章miR-155真核表达载体的构建、鉴定及表达

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 主要溶液的配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 HepG2．2．15细胞基因组DNA提取

2．2．2 pmiR-155真核表达质粒的构建

2．2．3 pmiR-155真核表达质粒的鉴定

2．2．4 pmiR-155真核表达质粒的表达

2．2．5 统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 pmiR-155真核表达载体的构建及鉴定

2．3．2 细胞内荧光检测

2．3．3 pmiR-155真核表达质粒的表达

2．4 讨论

2．4．1 人miR-155真核表达载体构建成功

2．4．2 重组载体pmiR-155提高细胞内miR-155表达量

第三章 miR-155在HBV慢性感染中调节免疫应答作用

3．1 实验材料

3．1．1 细胞系及质粒

3．1．2 主要试剂及试剂盒

3．1．3 主要溶液的配制

3．1．4 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 预测人miR-155靶基因位点

3．2．2 RT-PCR检测各组SOCS-1 mRNA变化

3．2．3 Western blot检测各组SOCS-1蛋白变化

3．2．4 ELISA检测各组细胞IFN-γ分泌量变化

3．2．5 ELISA检测各组细胞IL-2分泌量变化

3．2．6 统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 SOCS-1是miR-155的靶位点

3．3．2 miR-155抑制SOCS-1 mRNA表达

3．3．3 miR-155抑制SOCS-1蛋白表达

3．3．4 miR-155促进IFN-γ和IL-2分泌

3．3．5 miR-155与SOCS-1 mRNA和细胞因子的相关性分析

3．4 讨论

3．4．1 miRNA的免疫调节作用及其对HePG2．2．15细胞中IFN-γ、IL-2的影响

3．4．2 miR-155干预SOC8-1对IFN-γ、IL-2的负反馈调节作用

第四章 mi R-155对HBV复制及表达的影响

4．1．实验材料

4．1．1 细胞系及质粒

4．1．2 主要试剂及试剂盒

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 人miR-155序列RT-qPCR扩增

4．2．2 乙型肝炎病毒表面抗原定量检测

4．2．3 乙型肝炎病毒e抗原定量检测

4．2．4 乙型肝炎病毒核酸定量检测

4．2．5 统计分析

4．3．实验结果

4．3．1 miR-155对HBsAg和HBeAg的抑制作用

4．3．2 miR-155对HBV DNA的抑制作用

4．3．3 miR-155和HBV蛋白和HBV DNA的相关性分析

4．4 讨论

4．4．1 HepG2．2．15细胞与HBV

4．4．2 miR-155抑制HBV的可能机制

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢